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L’attività di ricerca dell’IRCCS San Raffaele Pisana è organizzata, all’interno di ciascun Dipartimento, secondo le linee di ricerca previste dal programma di Ricerca Corrente.

La seguente ricerca rientra all’interno della Linea 4 “Le disabilità dello sviluppo e neuroriabilitazione pediatrica”:

1. Correlazione tra voxel-based morphometry e gait analysis in individui affetti da paralisi cerebrali infantili

2. Studio morfovolumetrico single-case (sc-vbm mri) delle strutture corticali e sottocorticali in individui con sindrome di down e disturbi della deambulazione

3. L'analisi volumetrica voxel-per-voxel delle strutture encefaliche e biomarkers prelevate da campioni ematici in soggetti affetti da Sindrome di Down

4. Valutazione del profilo farmacogenetico delle persone con Sindrome di Down con particolare riferimento alla depressione e alla risposta agli antidepressivi (inibitori del re-uptake della serotonina) 

5. Fattori di rischio cardiovascolare nella Sindrome di Down 

6. Studio del pattern coagulatorio in bambini con emiparesi infantile di tipo spastico e/distonico di incerta etiologia

7. Proteomic approach to mouse model of Down Sindrome

8. Relazioni tra difficoltà di apprendimento e plasticità cerebrale nel modello murinico trisomico

1. Correlazione tra voxel-based morphometry e gait analysis in individui affetti da paralisi cerebrali infantili

La paralisi cerebrale infantile (CPI) è un disturbo persistente ma non progressivo della postura e del movimento dovuto ad alterazioni della funzione cerebrale infantile prima che il sistema nervoso centrale abbia completato il suo sviluppo. La paralisi cerebrale infantile non è un disturbo omogeneo, poiché la patologia può assumere livelli diversi di gravità e manifestarsi in forme anche molto differenti l’una dall’altra. La classificazione più seguita a livello internazionale è basata su criteri che combinano la localizzazione topografica delle difficoltà motorie (es. difficoltà a livello di un emilato corporeo) con le caratteristiche anomale del movimento (es. ipertonia di tipo spastico). Le forme tetraplegiche risultano le più frequenti, assommando a circa 1/3 di tutti i casi di paralisi cerebrale infantile. La misurazione del grado di coinvolgimento motorio si avvale di strumenti di valutazione quantitativa quali la Gait analysis che misura le alterazioni motorie conseguenti alla patologia, fornendo informazioni dettagliate relative alla cinematica (velocità, accelerazioni, traiettorie), alla dinamica (forze e potenze articolari) e all’attività muscolare. Si effettua applicando dei sensori sul corpo del paziente che vengono ripresi da un sistema opto-elettronico a 12 telecamere ed utilizzando delle piattaforme di forza e un sistema elettromiografico che rileva l’attività muscolare. Tutto ciò permette di monitorare qualsiasi parte del corpo umano, di analizzare al computer i problemi funzionali di ciascun individuo e, soprattutto, di quantificare l’efficacia delle diverse terapie riabilitative”.
 La "voxel based morphometry" (VBM) è una tecnica MRI che permette lo studio morfometrico dell'intero cervello, completamente automatica e molto sensibile, che è in grado di individuare alterazioni strutturali regionali attraverso un confronto voxel per voxel di due gruppi di soggetti. Mediante il confronto di gruppi di soggetti, il metodo di VBM è in grado di rilevare minime differenze di densità della sostanza grigia cerebrale permettendo il rilievo di "lesioni" cerebrali non evidenti con indagini MRI convenzionali.
La presente ricerca si prefigge di effettuare lo studio morfovolumetrico di singoli soggetti con CPI rispetto ad un gruppo di controllo. E’ possibile correlare i dati morfovolumetrici di specifiche regioni cerebrali di un individuo con CPI con parametri clinici motori rilevati mediante gait analysis. Da ciò ne consegue la possibilità di determinare le potenziali caratteristiche diagnostiche di un tool, operante su gruppi di individui come anche su singoli, in grado di correlare  dati morfovolumetrici con dati optometrici relativi al movimento.
Recenti studi di morfovolumetria MRI hanno mostrato un pattern specifico di distribuzione dei processi lesionali a carico delle strutture cerebrali nel caso di CPI. Obiettivo dello studio è la possibilità di correlare specifici pattern di modificazione di strutture cerebrali caratteristici di individui con CPI ed i disturbi dello schema del passo.
Esistono attualmente due principali tecniche di indagine morfovolumetrica: i) la Region Of Interest technique e ii) la Voxel Based Morphometry.
Una acquisizione MRI strutturale 3D è stata effettuata su 20 soggetti utilizzando la sequenza pesata in T1 "magnetization prepared rapid gradient echo"  per ottenere fette assiali con voxel della dimensione di 1x0.98x0.98 mm.
Il post-processing dei dati è in corso di reallizzazione utilizzando il software "statistical parametric mapping" (SPM), Wellcome Department of Cognitive Neurology, London, UK, che utilizza una piattaforma Matlab (Mathworks, Sherborn, MA, USA).
L'analisi dei dati ha compreso la normalizzazione spaziale, segmentazione e smoothing spaziale. Infine l'analisi statistica è stata effettuata per individuare differenze statistiche tra gruppi durante la deambulazione (Gait Analysis).
E’ stato possibile correlare i dati morfovolumetrici di specifiche regioni cerebrali di un individuo con CPI con parametri clinici motori rilevati mediante gait analysis. La metodica messa a punto costituisce di fatto il primo passo della messa a punto di un procedimento di valutazione quantitativa di dati morfovolumetrici derivanti da MRI di un singolo individuo come anche di gruppi direttamente correlabili con un disturbo di tipo motorio. I risultati evidenziati dall’analisi statistica sin qui effettuata evidenziano una correlazione tra grado di impairment motorio e coinvolgimento delle strutture cerebrali corticali e sottocorticali.

2. Studio morfovolumetrico single-case (sc-vbm mri) delle strutture corticali e sottocorticali in individui con sindrome di down e disturbi della deambulazione

La Sindrome di Down (trisomia del cromosoma 21) è determinata da una alterata espressione di geni soprannumerari che conduce all’aumento della sintesi di alcuni substrati; solo una piccola porzione del cromosoma 21° necessita di essere triplicata; tale insieme di geni (circa 20-50), denominato Down Syndrome Critical Region, è implicato nella generazione del fenotipo. Uno degli aspetti più evidenti di tale patologia è la larga varietà di alterazioni presenti ed il diverso grado di gravità che queste possono assumere nei differenti individui.
I disturbi della deambulazione mostrano una incidenza maggiore negli individui affetti da sindrome di Down (DS) rispetto alla popolazione normale. Tale disturbo motorio è determinato nella popolazione di pazienti Down da molteplici fattori quali macroscopiche anomalie strutturali cerebrali, aumentata lassità legametosa, ipotonia e una alterazione ultrastrutturale a carico della muscolatura scheletrica. Negli ultimi anni i disturbi della deambulazione possono essere valutati quantitativamente grazie a tecniche optometriche di rilevazione del movimento (Gait Analysis).
La "voxel based morphometry" (VBM) è una tecnica MRI che permette lo studio morfometrico dell'intero cervello, completamente automatica e molto sensibile, che è in grado di individuare alterazioni strutturali regionali attraverso un confronto voxel per voxel di due gruppi di soggetti. Mediante il confronto di gruppi di soggetti, il metodo di VBM è in grado di rilevare minime differenze di densità della sostanza grigia cerebrale permettendo il rilievo di "lesioni" cerebrali non evidenti con indagini MRI convenzionali.
Recenti studi di morfovolumetria RMI hanno mostrato un pattern specifico di progressione dei processi degenerativi delle strutture cerebrali. Obiettivo dello studio è la possibilità di correlare pattern di modificazione di strutture cerebrali caratteristici di individui con DS ed i disturbi dello schema del passo.
Esistono attualmente due principali tecniche di indagine morfovolumetrica: i) La Region Of Interest technique e ii) la Voxel Based Morphometry. La prima definisce e rileva differenze a carico di preselezionate strutture corticali, la seconda analizza dal punto di vista volumetrico tutte le strutture cerebrali rispetto ad una variabile (clinica, genetica, etc). Attualmente tale metodica si è arricchita di un nuovo tool statistico che consente di correlare pattern di modificazione di strutture cerebrali caratteristici di singoli individui.
Lo scopo del presente progetto consiste nello studio morfovolumetrico di singoli soggetti con DS rispetto ad un gruppo di controllo. Il progetto si prefigge di: a) correlare i dati morfovolumetrici di specifiche regioni cerebrali di un individuo con DS con parametri clinici motori rilevati mediante gait analysis; b) determinare le potenziali caratteristiche diagnostiche di un tool, operante su singoli individui, in grado di correlare  dati morfovolumetrici con dati optometrici relativi al movimento
Una acquisizione MRI strutturale 3D viene effettuata su 20 soggetti con DS e 20 controlli utilizzando la sequenza pesata in T1 "magnetization prepared rapid gradient echo"  per ottenere fette assiali con voxel della dimensione di 1x0.98x0.98 mm.
Il post-processing dei dati verrà effetuata utilizzando il software "statistical parametric mapping" (SPM), Wellcome Department of Cognitive Neurology, London, UK, che utilizza una piattaforma Matlab (Mathworks, Sherborn, MA, USA).
L'analisi dei dati ha compreso la normalizzazione spaziale, segmentazione e smoothing spaziale. Infine l'analisi statistica è stata effettuata per individuare differenze statistiche tra gruppi.
Le immagini normalizzate spazialmente vengono quindi segmentate in tre compartimenti, sostanza grigia, bianca e liquido cefalo-rachidiano, utilizzando una tecnica di cluster analisi. Infine tutte le immagini sono sottoposte a smoothing  (convoluzione con Kernel isotropico Gaussiano di 8 mm di larghezza a mezza altezza; FWHM).
L'analisi statistica viene effettuata voxel per voxel utilizzando il "general linear model" (GLM) e testando per specifiche differenze regionali della sostanza grigia e bianca attraverso il confronto tra singolo individuo con DS  e soggetti di controllo. Per individuare differenze attraverso tutto il cervello viene usata una soglia pari a P < 0.001. Le coordinate risultanti vengono localizzate anatomicamente nello spazio stereotassico di Talairach.
E’ stato possibile correlare i dati morfovolumetrici di specifiche regioni cerebrali di un individuo con CPI con parametri clinici motori rilevati mediante gait analysis. La metodica messa a punto costituisce di fatto il primo passo della messa a punto di un procedimento di valutazione quantitativa di dati morfovolumetrici derivanti da MRI di un singolo individuo come anche di gruppi direttamente correlabili con un disturbo di tipo motorio. I risultati evidenziati dall’analisi statistica evidenziano una correlazione tra grado di impairment motorio e coinvolgimento delle strutture archi e paleo – cerebellari.

3. L'analisi volumetrica voxel-per-voxel delle strutture encefaliche e biomarkers prelevate da campioni ematici in soggetti affetti da Sindrome di Down

La Sindrome di Down (trisomia del cromosoma 21) è determinata da una alterata espressione di geni soprannumerari che conduce all’aumento della sintesi di alcuni substrati; solo una piccola porzione del cromosoma 21° necessita di essere triplicata; tale insieme di geni (circa 20-50), denominato Down Syndrome Critical Region, è implicato nella generazione del fenotipo. Uno degli aspetti più evidenti di tale patologia è la larga varietà di alterazioni presenti ed il diverso grado di gravità che queste possono assumere nei differenti individui.
La "voxel based morphometry" (VBM) è una tecnica MRI che permette lo studio morfometrico dell'intero cervello, completamente automatica e molto sensibile, che è in grado di individuare alterazioni strutturali regionali attraverso un confronto voxel per voxel di due gruppi di soggetti. Mediante il confronto di gruppi di soggetti, il metodo di VBM è in grado di rilevare minime differenze di densità della sostanza grigia cerebrale permettendo il rilievo di "lesioni" cerebrali non evidenti con indagini MRI convenzionali.
Recenti studi di morfovolumetria RMI hanno mostrato una correlazione tra caratteristiche morfovolumetriche cerebrali di individui con DS e biomarkers.
Lo studio si prefigge di studiare i pattern morfovolumetrici cerebrali di bambini ed adolescenti con DS rispetto ad un gruppo di controllo bilanciato per età e sesso e loro correlazione con biomarkers e di effettuare una valutazione del grado di predicibilità di potenziali alterazioni morfostrutturali cerebrali procedendo ad un esame relativamente agevole di biomarkes ematici.
Esistono attualmente due principali tecniche di indagine morfovolumetrica: i) La Region Of Interest technique e ii) la Voxel Based Morphometry. La prima definisce e rileva differenze a carico di preselezionate strutture corticali, la seconda analizza dal punto di vista volumetrico tutte le strutture cerebrali rispetto ad una variabile (clinica, genetica, etc). Attualmente tale metodica si è arricchita di un nuovo tool statistico che consente di correlare pattern di modificazione di strutture cerebrali caratteristici di singoli individui.
Una acquisizione MRI strutturale 3D è stata effettuata effettuata su 10 soggetti con DS con  20<IQ<34 e su 10 soggetti sani (babini ed adolescenti) non affetti da cromosomopatie, con IQ> 69 omogenei per età e sesso al gruppo con DS (il numero ottimale di soggetti sperimentali per effettuare ricerche di volumetria cerebrale è 20).
E’ utilizzata la sequenza pesata in T1 "magnetization prepared rapid gradient echo"  per ottenere fette assiali con voxel della dimensione di 1x0.98x0.98 mm.
Il post-processing dei dati è effetuato utilizzando il software "statistical parametric mapping" (SPM), Wellcome Department of Cognitive Neurology, London, UK, che utilizza una piattaforma Matlab (Mathworks, Sherborn, MA, USA).
L'analisi statistica è effettuata voxel per voxel utilizzando il "general linear model" (GLM) e testando per specifiche differenze regionali della sostanza grigia e bianca attraverso il confronto tra singolo individuo con DS  e soggetti di controllo. Le coordinate risultanti sono state localizzate anatomicamente nello spazio stereotassico di Talairach. Sono stati acquisiti campioni ematici da individui con DS  e dal gruppo di controllo.
La valutazione dei risultati derivanti dalla ricerca ha consentito di individuare un primo gruppo di biomarkers di soggetti coinvolti nella ricerca e correlarli con i pattern morfovolumetrici MRI di individui con DS. La ricerca condotta su un numero adeguato di invidi con DS (almeno 40) consentirà di valutare la possibilità di potenziali alterazioni morfostrutturali cerebrali procedendo ad un esame relativamente agevole di biomarkes ematici.

4. Valutazione del profilo farmacogenetico delle persone con Sindrome di Down con particolare riferimento alla depressione e alla risposta agli antidepressivi (inibitori del re-uptake della serotonina)

Nei giovani adulti con sindrome di Down è descritta una maggiore incidenza di depressione (6 – 13%), che spesso si manifesta in maniera atipica rispetto alle persone normodotate, con un quadro clinico di declino funzionale.
Secondo questa diagnosi di depressione, seguendo rigidi protocolli diagnostici, viene prescritta la terapia elettiva (antidepressivi inibitori del re-uptake della serotonina) che, nella maggior parte dei casi, porta ad un netto miglioramento della sintomatologia depressiva tranne in un certa percentuale di casi in cui si osserva invece assenza di risposta e che si ritiene possano essere considerati “non responders” a questi farmaci.
Il presente studio si propone di identificare il profilo farmacologico dei pazienti con sindrome di Down con l’obiettivo di una personalizzazione della terapia antidepressiva.
Le manifestazioni cliniche in questi casi sono frequentemente “atipiche”, caratterizzate spesso da un declino funzionale precoce che impone una diagnosi differenziale con la Demenza di Alzheimer. Applicando i criteri diagnostici del DSM IV e la scala SPAID è possibile porre con certezza la diagnosi di depressione ed escludere la demenza di Alzheimer in questi pazienti con sindrome di Down ed importante declino funzionale.
La terapia antidepressiva elettiva è rappresentata dall’uso di inibitori del re-upteke della serotonina (fluexetina, paroxetina, citalopram) scelti in base alla tipologia dei sintomi associati al quadro depressivo.
La riposta alla terapia è generalmente rappresentata da un significativo miglioramento del tono dell’umore nei pazienti, tranne in un gruppo che si ritiene rappresenti dei non-responders.
Scopo del lavoro è quindi l’identificazione dei diversi profili farmacogenetici con l’obiettivo finale di una terapia antidepressiva personalizzata.
I presupposti teorici per cui soggetti diversi rispondono in modo diverso ad uno stesso farmaco somministrato alla stessa dose risiedono in parte nelle differenze individuali di assorbimento, metabolismo e clearance.  Inoltre possono esservi differenze anche nelle modalità specifiche con cui il farmaco esercita il suo effetto, quali, ad esempio, il legame del farmaco con il bersaglio molecolare su cui agisce. In base a tali presupposti, la maggior parte dei pazienti presenterà un miglioramento del quadro clinico in assenza o con lievi effetti collaterali, alcuni non risponderanno per nulla o presenteranno gravi effetti avversi da richiedere la sospensione del trattamento.
Questa variabilità è dovuta ad una combinazione di fattori costituzionali (età, sesso, ecc.), ambientali (dieta, abitudini voluttuarie, ecc.) e genetici che interagiscono con il farmaco, e le differenze riscontrabili sono mediate da un largo numero di enzimi, ciascuno dei quali è prodotto da uno specifico gene. Molti di questi geni sono polimorfici nella popolazione, ed alcune varianti genetiche producono enzimi con diversi livelli di attività metabolica o in processi che determinano efficacia e/o tossicità di un dato farmaco.
L'ossidazione è la più importante via metabolica dei farmaci, catalizzata dal sistema enzimatico epatico citocromo P450 (CYP). Nell'uomo circa 10 CYP sono attivi nei confronti dei farmaci e 3 di questi si presentano polimorfici: CYP2C9, CYP2C19 e CYP2D6.
Il CYP2D6, uno dei primi polimorfismi metabolici ad essere individuato ed ampiamente studiato, ha come substrati gli inibitori del re-uptake della serotonina paroxetina e fluoxetina.  La fluoxetina e il suo metabolita attivo norfluoxetina sono potentissimi inibitori del CYP2D6, pertanto durante la terapia con questo farmaco soggetti metabolizzatori normali modificano il proprio fenotipo a quello di metabolizzatori deboli.  In soggetti con metabolismo lento si osserva una riduzione o assenza di CYP2D6 epatico.  Bisogna inoltre ricordare che la fluoxetina ha un emivita plasmatica di circa una settimana e la norfluoxetina di quasi 3 settimane, il che significa che gli effetti bloccanti il CYP2D6 sono presenti parecchie settimane dopo la sospensione del farmaco. Uno degli obiettivi del programma è l’individuazione di marcatori molecolari in grado di valutare la risposta farmacologica con inibitori del re-uptake della serotonina. Tale obiettivo può essere raggiunto attraverso lo studio di geni codificanti proteine coinvolte nel metabolismo del farmaco da somministrare allo scopo di poter prevedere la risposta clinica al trattamento.  Una volta individuato un cluster di profili genici correlabile alle varie risposte cliniche alle terapie adottate sarà possibile progettare, sperimentare e validare test che si basino sulla tecnologia dei microchip mutazionali a DNA. Attraverso tale metodologia sarà possibile fornire un profilo genetico individuale da utilizzare quale ausilio nella scelta farmacologia grazie all’individuazione contemporanea di più varianti di sequenza polimorfiche in geni che controllano il metabolismo dei farmaci di scelta.
Viene effettuata una analisi retrospettiva di circa 1400 persone con sindrome di Down per la valutazione dell’incidenza di depressione; una revisione dei casi identificati di depressione e della risposta alla terapia.
Profilo farmacogenetico dei pazienti selezionati condotto secondo le seguenti linee-guida.
1. Diagnosi mutazionale effettuata sui principali geni coinvolti nel metabolismo degli inibitori del re-uptake della serotonina
2. Studio dei polimorfismi metabolici correlati alla risposta terapeutica al trattamento
3. Identificazione e validazione di nuovi polimorfismi che correlino in maniera statisticamente significativa con il trattamento farmacologico.
Campionamento biologico: il campionamento biologico avverrà con le modalità ed i tempi stabiliti comunemente con le unità cliniche in accordo con le linee guida suggerite, per gli studi di epidemiologia molecolare, dalla letteratura internazionale.
Il prelievo ematico di sangue periferico in EDTA deve essere sottoposto entro 24 ore a separazione linfocitaria e criopresevazione in guanidinio isotiocianato a –60/80° C. Per garantire l’idoneità del campionamento alla estrazione di mRNA e DNA in tempi successivi, verranno utilizzati apparati di criopreservazione appositamente dedicati.
Analisi mutazionale: individuazione di varianti di sequenze di geni coinvolti nei pathway metabolici di inibitori del re-uptake della serotonina mediante metodiche di diagnostica molecolare quali SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism), DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Cromathography) e sequenziamento diretto automatico. Il sequenziamento diretto viene effettuato nel caso in cui sia presente un pattern alterato di mobilità elettroforetica identificato con i test di screening.
Al fine di identificare anche quelle mutazioni che intervengono nelle regioni regolative dei geni e che sono fuori della regione codificante viene utilizzato il “complementary-DNA-based-protein truncation test assay”. Infine in casi selezionati, allo scopo di valutare grossi riarrangiamenti genici, dopo analisi molecolare completa, i campioni biologici dei pazienti oggetto dello studio vengono sottoposti ad analisi in southern blot, FISH e MLPA. L'assenza di mutazioni patogenetiche in tali geni indirizza verso la valutazione dei loro livelli di espressione tramite metodiche di real-Time-PCR e Primer extension.
Identificazione di SNPs (Single nucleotide polimorphysms): Si utilizzano enzimi di restrizione, primer extension e Real Time PCR per identificare varianti di sequenza utilizzabili come markers di diagnosi, progressione, prognosi e risposta alla terapia. Vengono valutati dapprima polimorfismi già riportati in letteratura quali ad esempio il CYP2D ed in seguito vengono valutati nuovi SNPs localizzati in geni coinvolti in diverse vie metaboliche non necessariamente strettamente implicate nel metabolismo degli inibitori del re-uptake della serotonina.  L’identificazione di più marcatori in disequilibrio fra loro permette la costruzione di profili di rischio farmacogenetici non necessariamente collegati a geni noti, ma sulla base dei quali si potrebbero comunque sviluppare dei test farmacogenetici predittivi della risposta ad un farmaco.
 
Sono stati raccolti campioni ematici da numerosi pazienti con sindrome di Down e sindrome depressiva in trattamento farmacologico con antidepressivi, responder e non-responder sul piano clinico, parte dei quali è già stata sottoposta a RMN encefalo con tecnica  di volumetria cerebrale e ad EEG quantitativo.
Lo step finale consiste nella ricerca di una eventuale la correlazione tra responder e non-responder a livello  clinico e profilo farmacogenetico.

5. Fattori di rischio cardiovascolare nella Sindrome di Down

Nell’ambito della sindrome di Down, il progressivo allungamento delle aspettative di vita rende conto dell’attenzione da porre verso quelle patologie “dell’adulto” finora raramente osservate e studiate in maniera sistematica per la scarsità di popolazione che raggiungeva un’età avanzata.
Mentre le conoscenze sulle cardiopatie congenite nella trisomia 21 sono approfondite e specifiche, quelle sull’invecchiamento e sulle patologie cardiovascolari “acquisite” sono minori.
La presente ricerca si pone come obiettivo la valutazione del rischio cardiovascolare in una popolazione di giovani-adulti con sindrome di Down, in assenza di cardiopatie congenite o altre patologie significative, rispetto ai parametri di normalità per la popolazione generale.
Le problematiche cardiologiche nella sindrome di Down sono state sinora quasi esclusivamente rappresentate dalle cardiopatie congenite (incidenza, tipo, trattamento, complicanze e follow-up). Scarsa attenzione è stata quindi rivolta alle patologie cardiovascolari acquisite, che pur rappresentano un’importante fattore di rischio di morbilità/mortalità nella popolazione generale.
Tra i fattori di rischio per le cardiopatie acquisite soprappeso, obesità e sedentarietà sono significativamente frequenti nella sindrome di Down, fattori dismetabolici (diabete, dislipidemia) sono anch’essi presenti, mentre i  fattori legati allo stile di vita (stress, fumo) sono più raramente presenti.
Come presupposto teorico, si parte dal dato di come uno stato infiammatorio cronico di basso grado ed una condizione protrombotica siano strettamente collegati e spesso connessi con l'obesità e la sindrome da insulino-resistenza, fattori di rischio emergenti per le malattie cardiovascolari.
La valutazione del rischio cardiovascolare è quindi attualmente possibile grazie a metodiche di laboratorio nate da numerosi contributi scientifici che hanno confermato l’importanza del ruolo delle citochine infiammatorie, tipo TNF-alfa, di animali obesi e che la neutralizzazione del TNF-alfa da parte del suo recettore solubile porta alla diminuzione della insulino-resistenza; successivammente è stato dimostrato che anche il tessuto adiposo umano è in grado di esprimere TNF-alfa, e che tale espressione è ridotta in seguito a calo ponderale. Simili osservazioni sono state ottenute anche riguardo le concentrazioni plasmatiche di TNF-alfa, mentre del tutto recentemente, è stato dimostrato che le cellule mononucleate circolanti nell'obeso sono in una condizione pro-infiammatoria, con un aumento nell'attività del fattore di trascrizione nucleare NF-kappaB e un aumento concomitante nell'espressione dei geni da esso modulati, compresi il TNF-alfa e l’interleuchina-6(IL-6). Infine, l'infiltrazione macrofagica del tessuto adiposo sembra essere una caratteristica dell'obesità. A tal proposito, alcuni autori hanno dimostrato che l’adipocita dell’animale obeso è caratterizzato da un profilo di espressione genica assimilabile a quello dei macrofagi, e che nel tessuto adiposo umano in condizioni di obesità è presente un’infiltrazione macrofagica di cui sia il BMI sia il diametro medio degli adipociti rappresentano importanti fattori predittivi. Pertanto, è ancora da chiarire se l’infiltrazione macrofagica sia causa o effetto dell’obesità, sebbene, al momento attuale, sia possibile ipotizzare che essa rifletta una risposta dell’organismo ad un abnorme metabolismo lipidico.
Tutti questi parametri possono essere facilmente valutati nei pazienti in esame grazie ad una sezione dedicata allo studio dell’assetto infiammatorio attraverso la determinazione di citochine pro- ed anti-infiammatorie (ad es. TNF-alfa, IL-6, e IL-10) mediante metodiche EIA, della PCR mediante una metodica immunonefelometrica ad alta sensibilità (hs-PCR), e della determinazione di alcune adipochine (leptina, adiponectina, resistita e grelina) mediante metodiche EIA.
A completamento dell’inquadramento clinico del paziente con rischio cardiovascolare il Laboratorio di Diagnostica Molecolare ha messo a punto profili specialistici per la diagnosi mutazionale effettuata con metodiche di screening molecolare ad alta sensibilità (DHPLC) sui principali geni coinvolti nell’infiammazione cronica di basso grado e nelle alterazioni del sistema emostatico-coagulativo.  In particolare, sono attive metodiche di screening molecolare ad alta sensibilità sui principali geni coinvolti nell’infiammazione cronica di basso grado associata all’obesità ed alla sindrome metabolica, quali ad esempio, varianti di sequenze di geni coinvolti nei meccanismi pro-infiammatori (IL-6, TNF-alfa e CRP), anti-infiammatori (IL-10) e nell’insulino-resistenza (IRS-1 ed adiponectina). Nel Laboratorio, infatti, sono a punto metodiche di diagnostica molecolare rivolte all’individuazione di varianti di sequenze di geni coinvolti nella definizione del rischio cardiovascolare mediante metodiche di diagnostica molecolare quali SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism), DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography) e sequenziamento diretto automatico da effettuarsi nel caso in cui sia presente un pattern alterato di mobilità elettroforetica identificato con i test di screening.  Al fine di identificare anche quelle mutazioni che intervengono nelle regioni regolative dei geni e che sono fuori della regione codificante viene utilizzato il “complementary-DNA-based-protein truncation test assay”.  Per l’identificazione di SNPs (Single nucleotide polimorphysms) si utilizzano enzimi di restrizione, primer extension e Real Time PCR per identificare varianti di sequenza utilizzabili come marcatori di diagnosi, progressione, prognosi e risposta alla terapia in pazienti con aumentato rischio cardiovascolare. 
Il crescente numero di persone con trisomia 21 che raggiunge l’età adulta induce a valutare attentamente questi aspetti, per analizzare il rischio cardiovascolare nella sindrome di Down, raffrontarlo con quello della popolazione generale di pari età, e proporre infine eventuali nuovi protocolli diagnostici che considerino queste problematiche nell’ambito generale dei follow-up medici.

6. Studio del pattern coagulatorio in bambini con emiparesi infantile di tipo spastico e/distonico di incerta etiologia

Nell’ambito dei disturbi della coordinazione motoria in età pediatrica, le emiplegie/emiparesi, a differenza delle doppie emiparesi, frequentemente si presentano in assenza di anamensi positiva per fattori di rischio perinatale (prematurità, basso peso, distress respiratorio) ma in bambini a termine e con normale adattamento neonatale e rimangono quindi classificate come di incerta etiologia.
Nelle emiplegie/emiparesi inoltre si nota un quadro lesionale alla RMN dell’encefalo caratteristico, con alterazioni corticali e sottocorticali di tipo malacico con sede anatomica corrispondente ai territori di distribuzione delle principali arterie cerebrali, in particolar l’arteria cerebrale media.
Nell’ipotesi che queste emiplegie/emiparesi possano essere causate da un incidente vascolare neonatale da coagulopatia, si propone lo studio dell’assetto coagulatorio in questi bambini, attualmente classificati come affetti da emiplegia/emiparesi infantile di incerta etiologia, con eventuale screening allargato ai familiari in caso di positività.
In particolare, ci si propone di svolgere un ampio pannello di analisi specialistiche volte a valutare il profilo di rischio pro-trombotico individuale.
Nel caso in cui il pattern coagulatorio risulti nella norma si potrebbero escludere le coagulopatie dalle cause etiologiche delle emiplegie/emiparesi infantili. Nel caso in cui il pattern coagulatorio risulti invece alterato le ricadute della ricerca saranno:
- prevenzione di eventi secondari nei pazienti a rischio stabilito
- studio dei collaterali (genitori, fratelli ed eventuali figli) per la ricerca di eventuali altri pazienti affetti.
Il programma prevede lo studio di 40 bambini (e 40 controlli) con le seguenti caratteristiche:
- nascita a termine
- peso adeguato
- APGAR maggiore di 7
- normale adattamento postatale
- diagnosi clinica di emiplegia/emiparesi entro il primo anno di vita
- RMN positiva per lesioni vascolari di tipo malacico in corrispondenza del territorio di vascolarizzazione di uno dei rami principali delle arterie cerebrali
Sarà eseguito il seguente studio dei fattori di coagulazione:
- analisi dell’assetto emostatico-coagulativo e definizione degli stati trombofilici (studi di funzionalità piastrinica, determinazione delle proteine C ed S, della resistenza alla proteina C attivata, ricerca del lupus anticoagulante ed anticorpi antifosfolipidi)
- metodica RT-PCR per l’analisi di polimorfismi comuni dei geni coinvolti nell’attivazione della cascata coagulativa (Protrombina anomala, MTHFR T677C, MTHFR A1298C e Fattore V Leiden)
- metodiche relative all’individuazione di altri polimorfismi probabilmente implicati nella predisposizione ereditaria allo stato trombofilico (PAI 1 mutazione 4G/5G, Alloantigeni piastrinici A1/A2, Polimorfismo H1/H2 del gene P2Y12 e polimorfismi A-842G e C50T del gene COX-1). 
I dati ottenuti vengono rapportati ai valori normali per età.

7. Proteomic approach to mouse model of Down Sindrome

Si definisce proteomica l'analisi sistematica di tutte le sequenze proteiche e le modalità con cui le proteine interagiscono tra di loro e nei tessuti. Si tratta di isolare, separare, identificare e determinare la funzione di tutte le proteine di un organismo.
Le proteine servono per trasmettere messaggi, costruire i tessuti biologici e ripararli e consentire lo svolgimento di tutte le funzioni essenziali per la vita della cellula. Quando questo processo si inceppa in qualche punto, si hanno manifestazioni patologiche e per capire come trattarle al meglio è fondamentale identificare le proteine associate al funzionamento anomalo che genera lo stato della malattia.
La proteomica si sta sviluppando secondo tre linee principali: la prima si occupa della micro-caratterizzazione delle proteine, della loro identificazione su larga scala e delle loro modificazioni; la seconda confronta i livelli proteici in situazioni e tessuti diversi e promette ricadute terapeutiche contro un ampio spettro di patologie; la terza area di ricerca, infine, studia le interazioni delle proteine tra loro e con i tessuti circostanti.
E' molto difficile prevedere il funzionamento di una proteina solo sulla base della struttura, anche se confrontata con altre strutture proteiche analoghe. Per effettuare una corretta analisi funzionale, sembra dunque fondamentale comprendere come le proteine si strutturano in complessi proteici e si correlano alla struttura della cellula nel suo complesso
I modelli animali hanno affiancato la tradizionale sperimentazione sull’uomo negli studi rivolti a chiarire il ruolo dei geni presenti sull’extra cromosoma sul fenotipo della sindrome da trisomia 21.
In particolare è stato creato un topo portatore di trisomia della regione distale del cromosoma 16, il segmento ortologo alla regione implicata nel determinismo della sindrome di Down sul cromosoma 21 (Epstein CJ, The Consequences of chromosome imbalance, Cambridge University Press, 1986): questo modello ha riprodotto molte delle stigmate cliniche della sindrome umana.
Il modello murinico Ts65Dn ha un tratto del suo cromosoma 16 in triplice dose e questo determina una trisomia costitutiva di 78 geni analoghi a quelli del cromosoma 21 umano. Il patrimonio genetico umano è per l’80% identico a quello del topo pertanto è possibile utilizzare questo animale come modello per gli studi che non si possono effettuare sull’uomo.
I geni del cromosoma 21 sono stati studiati indirettamente utilizzando i geni ortologhi (corrispondenti) del topo che si trovano sui cromosomi 16, 17 e 10.
Sono stati eseguiti due grandi studi, il primo è partito da un catalogo di 178 geni del cromosoma 21 umano e di questi ne sono stati trovati 161 omologhi nel topo. L’espressione genetica è stata valutata in quattro stadi temporali embrionali e in 12 tessuti del topo adulto. La complessità più alta dell’espressione si è avuta nel cervello e nel rene, con l’85% dei geni espressi in ciascun tessuto. Il secondo studio è partito da un catalogo di 238 geni creato analizzando la sequenza completa del DNA del Ch21, e sono stati trovati 168 geni ortologhi nel topo. La correlazione tra i dati degli atlanti di espressione e le caratteristiche specifiche della DS può servire come guida per identificare i geni (o gruppi di geni) responsabili dei fenotipi patologici. Un esempio è il gruppo dei cinque geni mostranti livelli d’espressione concentrati nel cuore in sviluppo dove, detti geni sono sul Ch 21 nella regione critica per i difetti cardiaci congeniti presenti nella Sindrome di Down.
Il fenotipo del modello animale Ts65Dn è il risultato di un aumento dell’espressione di alcuni geni del cromosoma 16 e degli effetti, sia diretti che indiretti, che questo incremento può causare ( es. interazioni con altri geni non triplicati). I topi Ts65Dn sembrano soddisfare molti criteri per essere un solido modello animale per la sindrome di Down ed al contrario di altri modelli questi animali sopravvivono all’età adulta.
La Sindrome di Down è una sindrome aneuploide causata dalla trisomia del cromosoma 21. E’ la più frequente anomalia cromosomica ed avviene con l’incidenza di una nascita su 700-1000. All’alterato genotipo si associano un modesto deficit dell'accrescimento, un ritardo dello sviluppo motorio e del linguaggio nonché ritardo mentale moderato o severo caratterizzato da deficit di memoria spaziale a breve e lungo termine
Il ritardo mentale è la causa più comune d’invalidità nei soggetti SD, rappresentando una condizione caratterizzata da un’anormale funzione intellettuale e da una mancanza dei comportamenti d’adattamento sociale, che diventano sempre più evidenti con il passare degli anni. L’evidente atrofia dell’encefalo adulto di soggetti con sindrome di Down (SD) che contribuisce alle caratteristiche fenotipiche del ritardo mentale potrebbero dipendere principalmente da difetti di neurogenesi e di differenziamento neuronale nel cervello fetale. I soggetti Down presentano inoltre brachicefalia, fenotipo oculare, cardiopatie congenite, aumento del rischio di leucemia, difetti di accrescimento, deficit cognitivi che consistono in un ritardo dello sviluppo, deficit nel linguaggio e nella memoria, con anomalie cognitive del processamento uditivo verbale ed infine l’insorgenza della depressione. Anatomicamente il cervello ed i suoi emisferi hanno dimensioni significativamente ridotte si ha inoltre una riduzione degli strati corticali IIe IV; l’albero dendritico è relativamente atrofico già a quattro mesi di vita, il numero delle sinapsi è ridotto, la mielinizzazione è ritardata e si associa ad alterazioni elettrofisiologiche della membrana cellulare. A livello microscopico si nota una alterazione della densità neuronale, specialmente a livello del terzo strato corticale e del numero di neuroni che si può presentare ridotto fino al 50%.
Ogni cromosoma, in rapporto alle sue dimensioni, contiene un certo numero di geni e quindi una “dose” in più del cromosoma, come ad esmpio quella associata ad una trisomia, può produrre in media un terzo di prodotti genici in più, rispetto a quelli attesi nelle persone a cariotipo normale euploide. Gli effetti della trisomia del Ch 21 sullo stato di espressione dei geni è oggi spiegata dalle due seguenti ipotesi:
La prima attribuisce, in “toto”, il fenotipo dei soggetti Down ai geni in triplice dose.
La seconda attribuisce ai geni in triplice dose la responsabilità di causare un’instabilità genomica generale che a sua volta crea fenotipi patologici.
La maggior parte delle proteine codificate dai geni presenti sul cromosoma 21 sembra avere un ruolo di modulazione di numerosi processi neurofisiologici tra cui i complessi sistemi delle funzioni cognitive.   
In questo studio, ci si è focalizzati sul cervello e sulle possibili cause ed i meccanismi del ritardo mentale in soggetti con SD. Lo studio è stato condotto in parallelo: nel modello murino Ts65Dn e nell’uomo, con lo scopo di ottenere informazioni comparabili che ci permettessero di accertare in che misura le alterazioni dello sviluppo del sistema nervoso nel modello animale e nell’uomo fossero sovrapponibili.
Alla luce dei risultati ottenuti nel 2006, è stata analizzata l’espressione proteica dell’Anidrasi Carbonica II nelle diverse aree cerebrali umane: corteccia frontale, temporale e materia bianca.
I soggetti con Sindrome di Down hanno disfunzioni cognitive che, come generalmente accettato, sono il risultato di un upregulation dei geni presenti sul cromosoma 21 e poiché sono stati riscontrati oltre 400 geni presenti sul braccio lungo del cromosoma 21 ognuna delle proteine codificate da questi geni potrebbe essere un potenziale biomarcatore della regolazione dei suddetti processi. Quindi oltre alla valutazione genotipo/fenotipo, si è iniziato a valutare anche le interazioni proteina/proteina ( interattomica ) correlate ad un fenotipo cognitivo
Applicando la tecnologia proteomica al modello murino Ts65Dn, è stato possibile individuare ed identificare proteine variamente espresse tra il campione sano ed il trisomico parziale come ad esmpio l’enzima Anidrasi Carbonica II da noi individuata.
L’anidrasi carbonica nei mammiferi ricopre un ruolo chiave nella regolazione dell’equilibrio dei fluidi biologici, in particolare nel cervello (microglia, astrociti e oligodendrociti )  regola il pH intracellulare delle cellule nervose e il fluido cerebro/spinale (Haapasalo et al., 2007). Il risultato cardine della ricerca è stato quello di aver scoperto che l’anidrasi carbonica II sembra essere coinvolta nella patologia della Sindrome di Down, l’evidenza emerge dal momento che in entrambe le campionature: uomo e topo abbiamo riscontrato un chiaro incremento dei livelli proteici di suddetta proteina.
La disponibilità dei dati di sequenza genomica e le nuove tecniche di ionizzazione in spettrometria di massa, hanno contribuito a rendere possibile la focalizzazione delle metodologie di studio a livello proteico. La totalità delle proteine espresse dal genoma di un organismo è stata denominata
“proteoma” e l’analisi parallela massiva delle variazioni quantitative delle proteine espresse è detta proteomica.
La grande varietà delle proteine e la complessità che caratterizza i sistemi biologici richiedono il ricorso a tecnologie estremamente sofisticate.
Il nucleo della proteomica consiste nella simultanea separazione di migliaia di polipeptidi tramite elettroforesi e la loro successiva identificazione. In questa fase gioca un ruolo fondamentale la spettrometria di massa combinata con altri potenti prodotti della tecnologia bioinformatica. Una delle tecnologie di punta è denominata MALDI (acronimo da matrix-assisted laser desorption ionization) e consiste in una tecnica di spettroscopia di massa ideata una decina di anni fa e rivelatasi particolarmente adatta all'analisi proteica.

8. Relazioni tra difficoltà di apprendimento e plasticità cerebrale nel modello murinico trisomico

Attualmente sono in corso due esperimenti, progettati per migliorare il deficit d’apprendimento in topi Ts65Dn attraverso sostanze che hanno dimostrato avere un effetto salutare sulla funzione cerebrale:

• Effect of a systemically (i.p.) administered peptide on neurogenesis in the hippocampus and learning the Morris Water Maze in Ts65Dn
• Effect of taurine (a non-essential amino acid found in the brain and other body tissues) on learning and gabaergic brain neurochemistry of Ts65Dn mice.