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Home>IRCCS San Raffaele Pisana>Ricerca Scientifica>Linea 2.

Linea 2.

L’attività di ricerca dell’IRCCS San Raffaele Pisana è organizzata, all’interno di ciascun Dipartimento, secondo le linee di ricerca previste dal programma di Ricerca Corrente.

Le seguenti ricerche rientrano nella Linea 2 “Meccanismi di recupero funzionale della patologia cronica e disabilitante: analisi dei determinanti di outcome” :

1. Effetto dell’esercizio fisico solo o associato a terapie mediche specifiche sul controllo metabolico e sul recupero funzionale in pazienti di entrambi i sessi con malattia cardiovascolare e/o aumentato rischio cardiovascolare

2. Importanza dell’assetto glucidico nel determinismo delle patologie cardiovascolari e sua influenza sul recupero funzionale in pazienti con malattie cardiovascolari sottoposti a cicli di riabilitazione cardiovascolare

3. Effetto delle influenze ambientali, ormonali e delle differenze di genere sulla genesi del danno e sul recupero funzionale cardiovascolare

4. Trattamento cronico con inibitori della fosfodiesterasi 5 per la prevenzione della progressione dell aterosclerosi

5. Importanza dell'assetto genetico nel determinare la distribuzione della aterosclerosi e la risposta vascolare

6. Effetto della terapia con Acidi grassi N3 sulla prevenzione della fibrillazione atriale in pazienti cardio-operati sottoposti a cicli di riabilitazione cardiovascolare

7. Effetto del training fisico sul controllo metabolico in pazienti con aumentato rischio cardiovascolare

8. Valutazione dell'efficacia del training fisico in associazione alla terapia con farmaci sensibilizzanti la sensibilità periferica alla insulina sulla forza muscolare, sul consumo

9. Valutazione dell'efficacia di un programma di fitness metabolica in associazione a trattamenti combinato di Calcio antagonista e statina a dosaggio preordinato rispetto alla terapia con ACE-inibitori ed individualizzazione del trattamento lipidico sul rischio cardiovascolare globale, sui markers di infiammazione e sui livelli circolanti di cellule endoteliali progenitrici di base e dopo esercizio

10. Influenza del training fisico in associazione a nuove terapie di associazione farmacologica sul metabolismo lipidico in pazienti con sindrome metabolica

11. Predisposizione genetica alle malattie cardiovascolari

12. Valutazione di eventuali differenze nel pattern e grado di attivazione infiammatoria vascolare e nell'espressione genica in pazienti con POAD, in presenza o meno di altre localizzazioni della malattia aterosclerotica

13. Effetto del fumo di sigaretta sulla funzione endoteliale e sui meccanismi apoptotici in diversi modelli cellulari del sistema cardiovascolare. Studio in cronico ed in acuto su una popolazione di fumatori

14. Il grado di ostruzione al flusso delle vie aeree in pazienti BPCO misurato con i tests di funzionalità respiratoria quale indice predittivo dell’aumentato rischio di desaturazioni notturne indipendentemente dai valori di saturazione ossiemoglobinica e di PaO2 da svegli e dalla presenza di patologie respiratorie associate (Overlap Syndrome)

15. Benefici della riabilitazione respiratoria su pazienti affetti da BPCO stabilizzata in terapia con formeterolo, fluticasone e tiotropio. Analis di alcuni parametri funzionali respiratori, della tolleranza allo sforzo fisico e della qualità di vita

16. Effetti della riabilitazione pre e post-operatoria in pazienti da sottoporre a chirurgia toracica maggiore

17. Effetti della riabilitazione pre e post-operatoria in pazienti da sottoporre a chirurgia toracica maggiore

18. Valutazione dell’efficacia e dell’entità dell’effetto sinergico della Riabilitazione Respiratoria in associazione al nuovo sistema TPEP (Temporary Positive Expiratory Pressure) sulla rimozione delle secrezioni bronchiali, la funzionalità respiratoria, la sintomatologia dispnoica e la tolleranza allo sforzo fisico nei pazienti affetti da BPCO con componente ipersecretiva

19. BRED: Studio “osservazionale” finalizzato a valutare ed analizzare la correlazione tra la Funzionalità Respiratoria e la Broncopneumopatia Cronica Ostruttiva (BPCO) e la Disfunzione Erettile (DE)

20. Riabilitazione neuronale: studio del danno subletale nelle patologie neuronali degenerative e loro riparazione molecolare

21. Ruolo delle proteine SIRT nella riabilitazione neuromotoria

22. Livelli ridotti di NGF e della proteina TrkA e dell’espressione genica di TrkA nel nervo ottico di ratti con glaucoma indotto sperimentalmente

23. Degenerazione dei miofilamenti e disfunzione dei cardiomiociti umani nella malattia di Fabry

24. Identificazione di marcatori biologici di malattia o di risposta alle terapie in pazienti affetti da Parkinson

II trattamento dei pazienti con malattie cardiovascolari e/o aumentato rischio cardiovascolare deve essere finalizzato al controllo dei fattori di rischio, alla ottimizzazione del metabolismo cardiaco ed al miglioramento della sua efficienza contrattile. Tali risultati possono esser raggiunti attraverso una ottimizzazione della terapia medica e mediante cicli di esercizio fisico aerobico. Il presente studio è volto a valutare l’effetto del training fisico da solo od in associazione a terapie di ottimizzazione del metabolismo cardiaco e di controllo della emodinamica cardiaca sul recupero funzionale di pazienti che abbiano già sofferto un evento cardiovascolare o che siano ad aumentato rischio cardiovascolare.
Il presente studio si propone di valutare la efficacia della ottimizzazione del metabolismo cardiaco su indici di efficienza contrattile e performance fisica in pazienti con malattia coronarica e ridotta funzione ventricolare sinistra
Sono stati arruolati pazienti di ambo i sessi con aumentato rischio cardiovascolare e/o con patologie cardiovascolari e/o cerebrovascolari sottoposti a cicli di riabilitazione cardiovascolare e metabolica.
Studio della capacità funzionale: viene effettuato il test del cammino dei 6 minuti in cui il paziente viene fatto deambulare su un percorso misurabile per 6 minuti. Ogni minuto viene valutata frequenza cardiaca, saturazione di ossigeno, grado di dispnea. Alla fine dei 6 minuti viene calcolata la distanza percorsa.
La capacità funzionale viene inoltre valutata tramite test cardiopolmonare al cicloergometro. Durante questo test gli scambi gassosi polmonari vengono misurati in continuo per determinare la soglia anaerobica ed il consumo massimo di ossigeno.
Studio della forza muscolare: la forza muscolare isocinetica è valutata con un sistema REV Technogym che valuta la energia prodotta dalle masse muscolari in movimento
Test di tolleranza glucidica: Previa misurazione dei valori di glicemia basale a mezzo di stick per la misurazione della glicemia sul sangue capillare (HGT), in tutti i pazienti viene inserita una butterfly venosa connessa a soluzione fisiologica in infusione lenta (20 ggt/minuto). Dopo esecuzione di un prelievo di base per la valutazione della glicemia ed insulinemia ai pazienti è chiesto di bere una soluzione contenente 75 g di glucosio. In seguito vengono eseguiti prelievi seriati a distanza di 30 minuti nei successivi 120 minuti. Ad ogni prelievo vengono ottenuti 5 cc di sangue che viene mantenuto in ghiaccio ed inviato entro 30 minuti al laboratorio analisi per la determinazione di glicemia ed insulinemia.
Studio della funzione ventricolare sinistra: tutti i pazienti sono sottoposti ad esame ecocardiografico secondo le linee guida della Società Europea di Cardiologia per la valutazione della funzione ventricolare sinistra e dei parametri funzionali di efficienza contrattile

I pazienti con malattie cardiovascolari sono frequentemente diabetici oppure hanno turbe del metabolismo glucidico. Tuttavia l’effetto dell alterato metabolismo glucidico e della sua ottimizzazione sul recupero funzionale di pazienti con patologie cardiovascolari non è stato chiarito. Il presente progetto si prefigge di valutare se le alterazioni metaboliche muscolari nei pazienti diabetici causano una minore efficienza metabolica con conseguente riduzione della forza muscolare ed aumento della fatica muscolare. Inoltre lo studio vuole valutare se la diminuita forza muscolare sia su base vasculogenetica o primariamente catabolica muscolare e pertanto si prefigge di valutare se i pazienti con turbe del metabolismo glucidico hanno un aumentato potere pro-apoptotico del siero e se un programma di fitness metabolica può esser in grado di diminuire tale potere e di migliorare la forza muscolare.
Sono arruolati pazienti di ambo i sessi con aumentato rischio cardiovascolare e/o con patologie cardiovascolari e/o cerebrovascolari
Test di tolleranza glucidica: previa misurazione dei valori di glicemia basale a mezzo di stick per la misurazione della glicemia sul sangue capillare (HGT) in tutti i pazienti è inserita una butterfly venosa connessa a soluzione fisiologica in infusione lenta (20 ggt/minuto). Dopo esecuzione di un prelievo di base per la valutazione della glicemia ed insulinemia ai pazienti viene chiesto di bere una soluzione contenente 75 g di glucosio. In seguito vengono eseguiti prelievi seriati a distanza di 30 minuti nei successivi 120 minuti. Ad ogni prelievo vengono ottenuti 5 cc di sangue mantenuto in ghiaccio ed inviato entro 30 minuti al laboratorio analisi per la determinazione di glicemia ed insulinemia.
Analisi delle proprietà pro-apoptotiche del siero su colture cellulari e valutazione del numero di cellule progenitrici endoteliali: tale studio viene effettuato mettendo in coltura cellule endoteliali di cordone ombelicale (HUVEC) con il siero dei pazienti ottenuto previo prelievo di 5 ml di sangue. Alla fine del trattamento le cellule vengono lavate 1X con PBS freddo e lisate in ghiaccio, sonicate, centrifugate e la concentrazione proteica nel sopranatante verrà determinata mediante metodo Bradford. Estratti cellulari contenenti 50 μg di proteine totali vengono corsi in un gel al 12% di acrilamide e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa che sarà incubata con anticorpi anti-Fas (45kDa), anti-Bcl-2 (27kDa) e anti-Bax (21kDa).
Il numero di cellule progenitrici endoteliali viene valutato mediante citofluorimetria con anticorpi specifici.
Studio della funzione endoteliale: sistema semipletismografico (Endopath) per valutazione istantanea del flusso ematico. La funzione endoteliale viene studiata durante iperemia reattiva o dopo somministrazione di dosi incrementali di Acetilcolina. La dilatazione endotelio indipendente viene valutata tramite somministrazione sublinguale di nitrati
Studio della elasticità vascolare: la pulse wave velocity e l Augmentation index (entrambi indici correlati con eventi cardiovascolari futuri) vengono misurate con il sistema Complior e Sphygmocor. Entrambi utilizzano un sistema monometrico per la detezione dell onda sfigmica.
Il reclutamento per lo studio è stato completato. Sono in fase di esecuzione le valutazioni basali ed i saggi biologici e sono state programmate le attività di follow up.

3. Effetto delle influenze ambientali, ormonali e delle differenze di genere sulla genesi del danno e sul recupero funzionale cardiovascolare

Esistono importanti differenze nella incidenza e manifestazione delle malattie cardio e cerebrovascolari tra i due sessi che sembrano esser correlate, almeno in parte, ad un effetto differente dei fattori di rischio cardiovascolari nei due sessi e dal differente assetto ormonale. I pazienti ipogonadici o con ipogonadismo relativo (post-menopausa, PADAM) hanno un rischio più alto di sviluppare malattie cardiovascolari suggerendo un effetto patogenetico della deprivazione ormonale nel determinismo delle malattie cardiovascolari.
Scopo del presente progetto è quello di valutare le differenze di genere nel determinismo delle malattie cardiovascolari e nella penetranza dei fattori di rischi. Inoltre il presente studio si propone di valutare l’effetto della somministrazione di testosterone nei pazienti di sesso maschile e di estrogeni da soli od in associazione a progestinici e/o testosterone nelle pazienti di sesso femminile con aumentato rischio cardiovascolare e/o con evidenti patologie cardiovascolari.
L’effetto dell’assetto ormonale e della terapia sostitutiva sulla capacità funzionale e sulla fisiologia
vascolare viene valutato mediante test cardiopolmonare, 6 min walking test, studio della funzione endoteliale e della elasticità vascolare.
Lo studio valuta l’effetto dell esercizio fisico da solo od associato a supplementazione ormonale sul recupero funzionale di pazienti con scompenso cardiaco o defaticamento muscolare.
Studi recenti hanno dimostrato differenze di genere nell adattamento all’esercizio fisico. Il presente studio valuta inoltre l’importanza della differenza di genere nel recupero funzionale in pazienti con cardio-vasculopatie.
Popolazione: pazienti di ambo i sessi con aumentato rischio cardiovascolare e/o con patologie cardiovascolari e/o cerebrovascolari
Test di tolleranza glucidica: Previa misurazione dei valori di glicemia basale a mezzo di stick per la misurazione della glicemia sul sangue capillare (HGT) in tutti i pazienti viene inserito un butterfly venoso connesso a soluzione fisiologica in infusione lenta (20 ggt/minuto). Dopo esecuzione di un prelievo di base per la valutazione della glicemia ed insulinemia ai pazienti è chiesto di bere una soluzione contenente 75 g di glucosio. In seguito vengono eseguiti prelievi seriati a distanza di 30 minuti nei successivi 120 minuti. Ad ogni prelievo vengono ottenuti 5 cc di sangue mantenuto in ghiaccio ed inviato entro 30 minuti al laboratorio analisi per la determinazione di glicemia ed insulinemia.
Analisi delle proprietà pro-apoptotiche del siero su colture cellulari e valutazione del numero di cellule progenitrici endoteliali. Tale studio viene effettuato mettendo in coltura cellule endoteliali di cordone ombelicale (HUVEC) con il siero dei pazienti ottenuto previo prelievo di 5 ml di sangue. Alla fine del trattamento le cellule vengono lavate 1X con PBS freddo e lisate in ghiaccio, sonicate, centrifugate e la concentrazione proteica nel sopranatante verrà determinata mediante metodo Bradford. Estratti cellulari contenenti 50 μg di proteine totali vengono corsi in un gel al 12% di acrilamide e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa che è incubata con anticorpi anti-Fas (45kDa), anti-Bcl-2 (27kDa) e anti-Bax (21kDa).
Il numero di cellule progenitrici endoteliali viene valutato mediante citofluorimetria con anticorpi Specifici.
Studio della funzione endoteliale: sistema semipletismografico (Endopath) per valutazione istantanea del flusso ematico. La funzione endoteliale viene studiata durante iperemia reattiva o dopo somministrazione di dosi incrementali di Acetilcolina, la dilatazione endotelio indipendente verra valutata tramite somministrazione sublinguale di nitrati
Studio della elasticità vascolare: la pulse wave velocity e l Augmentation index (entrambi indici correlati con eventi cardiovascolari futuri) vengono misurate con il sistema Complior e Sphygmocor. Entrambi i sistemi utilizzano un sistema monometrico per la detezione dell onda sfigmica.
Sono stati inclusi tutti i pazienti necessari alla valutazione dell’effetto del testosterone sulla capacità funzionale in pazienti con disfunzione ventricolare sinistro. E’ stato completato lo studio relativo all’effetto della supplementazione ormonale nelle donne con scompenso cardiaco ed il manoscritto è in fase di avanzata stesura.

4. Trattamento cronico con inibitori della fosfodiesterasi 5 per la prevenzione della progressione dell aterosclerosi

Lo studio in oggetto si basa sul presupposto che il deterioramento della funzione endoteliale vascolare è un passo iniziale verso lo sviluppo dell’ateroscerosi e che tale funzione sia maggiormente deteriorata nei pazienti con fattori di rischio cardiovascolare, in quelli con aumentato rischio cardiovascolare ed in quelli affetti da malattia aterosclerotica. L’endotelio è responsabile della regolazione del tono vascolare e della sua permeabilità, del mantenimento dell’equilibrio tra la coagulazione e la fibrinolisi, della progressione della aterosclerosi.
La disfunzione erettile (DE) è comune negli uomini con malattie vascolari ed in quelli con fattori di rischio cardiovascolare. In questi soggetti la disfunzione endoteliale contribuisce alla diminuzione della risposta vascolare peniena. E’ stata da tempo dimostrata l efficacia degli inibitori PDE5 nel trattamento orale di varie forme di DE. Studi recenti hanno ipotizzato che gli inibitori PDE5 possano non solo ridurre la degradazione di cGMP, ma anche aumentare la produzione di NO attraverso meccanismi genomici.
Studi precedenti hanno mostrato che un trattamento acuto con il sildenafil migliora la dilatazione flusso-mediata dell’arteria brachiale, fino a 24 ore dopo la somministrazione negli uomini con o senza disfunzione erettile. Studi recenti condotti dal nostro gruppo di ricercatori hanno dimostrato che la terapia cronica con il sildenafl migliora la funzione endoteliale negli uomini con un aumentato rischio cardiovascolare, con un effetto di grado pari a quello osservato con l’ Atorvastatina e che questi effetti permangono dopo la fine della terapia. Inoltre è stato dimostrato che in questi pazienti la terapia cronica con il sildenafil aumenta i livelli di nitriti/nitrati e fa diminuire i livelli plasmatici di sostanze vasocostrittrici.
Sulla base di questi presupposti si è ipotizzato che gli effetti vascolari complessivi dei PDE5I possano essere importanti nella prevenzione della progressione dell’ aterosclerosi nei pazienti con aumentato rischio cardiovascolare.
L’ipotesi dello studio è che la terapia cronica con il sildenafil abbia effetti vaso-protettivi che possano inibire la progressione dell’ aterosclerosi nei pazienti con un aumentato rischio cardiovascolare.
Nello specifico si ipotizza che la terapia cronica con il sildenafil migliori l’elasticità vascolare, riduca il grado di infiammazione vascolare, migliori la funzione endoteliale e rallenti la progressione dell aterosclersi.
Lo studio si propone di stabilire gli effetti della terapia cronica con sildenafil sull’infiammazione vascolare, la funzione e l’elasticità endoteliale e se questi effetti possano ridurre il progredire dello spessore intima-media della comune arteria carotidea nei pazienti con un aumentato rischio cardiovascolare.
La popolazione oggetto dello studio dovrà includere 100 pazienti consecutivi con un aumentato rischio cardiovascolare (>20%/10 anni).
Sono stati inclusi 76 pazienti. Secondo quanto specificato nel protocollo di studio sarà condotta una analisi statistica al reclutamento del 75% dei pazienti per valutare la appropriatezza del campione in esame ed eventualmente la prematura interruzione dello studio. Si prevede di completare il reclutamento per lo studio entro il primo semestre 2009.
Gli studi di funzionalità vascolare sono stati pubblicati.

5. Importanza dell'assetto genetico nel determinare la distribuzione della aterosclerosi e la risposta vascolare

Lo studio in oggetto si prefigge di valutare differenze nell’assetto genico in pazienti con diversa distribuzione anatomica della aterosclerosi. L'arteriopatia obliterante degli arti inferiori (AOP) rappresenta insieme alla malattia coronarica ed alla aterosclerosi carotidea una delle manifestazioni cliniche dell'aterosclerosi la cui prevalenza aumenta con l'aumentare dell'età e con l'esposizione ai fattori di rischio cardiovascolare, primi fra tutti il fumo di sigaretta e il diabete mellito. Per anni, la AOP ha ricevuto scarsa attenzione da parte dei clinici, in quanto è stata considerata una malattia ad andamento relativamente benigno e di scarsa diffusione. Infatti, dal punto divista clinico la AOP può decorrere a lungo asintomatica, sia per la elevata tolleranza all'ischemia del muscolo scheletrico, sia per la minor frequenza con cui viene raggiunta, soprattutto nel paziente anziano affetto da comorbidità e/o limitazioni funzionali, la soglia ischemica che causa la claudicatio intermittens, sia per la lenta evoluzione "locale" della malattia, che permette la formazione di circoli collaterali di compenso. A fronte di una relativa benignità "locale" della malattia, è noto che i pazienti con AOP hanno una riduzione dell' aspettativa di vita di circa 10 anni, legata soprattutto alla maggior incidenza di eventi cardiovascolari fatali al follow-up (principalmente dovuti alla cardiopatia ischemica ed in minor misura all'ischemia cerebrale ed alla rottura di un aneurisma).
Sebbene dal punto di vista epidemiologico sia ormai noto che le "diverse" localizzazioni della malattia aterosclerotica sono espressione della stessa malattia multisistemica, dal punto di vista fisiopatologico ancora non sono noti i meccanismi patogenetici per cui, nello stesso paziente la malattia aterosclerotica interessi maggiormente un distretto vascolare piuttosto che un altro o perchè soggetti diversi esposti ai medesimi fattori di rischio cardiovascolari abbiano una diversa evoluzione e localizzazione della malattia. A tal fine l'impiego dei microarrays per lo studio simultaneo di migliaia di geni potenzialmente coinvolti nella comparsa e nell'estensione della malattia aterosclerotica, e lo studio del grado di infiammazione vascolare nei pazienti con diverse manifestazioni della malattia ateroscloerotica costituiscono due elementi da cui la ricerca clinica non può prescindere per la comprensione della differente localizzazione ed evoluzione della malattia aterosclerotica. E’ noto che l'aterosclerosi è una patologia multifattoriale nella quale l'infiammazione vascolare svolge un ruolo chiave sia dal punto di vista patogenetico, intervenendo nella formazione, sviluppo e progressione della placca aterosclerotica, sia dal punto di vista prognostico, correlandosi gli alti livelli di markers infiammatori.
Se da una parte numerosi studi clinici hanno evidenziato la correlazione fra PCR, una proteina della fase acuta, sintetizzata dal fegato in risposta alla IL6, e la presenza e severità della malattia coronarica, dall’altra ancora sono pochi e discordanti i dati relativi al pattern ed al grado di infiammazione vascolare nell’ambito della AOP ed in relazione alla estensione della malattia aterosclerotica. Studi clinici recenti (Erren e Brevetti) sembrano, infatti, suggerire che nei soggetti contemporaneamente affetti da coronaropatia e AOP si abbia un maggior incremento dei markers di infiammazione vascolare ed una maggiore estensione della malattia coronarica, (maggior numero di pazienti con interessamento trivasale), rispetto ai soggetti affetti dalla sola coronaropatia. Sulla base delle suddette premesse si è ipotizzato che esistano delle differenze nel pattern e grado di infiammazione vascolare e nell'espressione dei geni coinvolti nell'aterosclerosi in pazienti anziani con AOP in presenza o meno di altre eventuali localizzazioni aterosclerotiche.
Gli obiettivi di questo studio sono quelli di verificare l’ esistenza di eventuali differenze nel pattern e nel grado di infiammazione vascolare in funzione dell’ estensione della malattia aterosclerotica (arteriosa e/o carotidea e/o coronarica), verificare differenze nella espressione genica nei pazienti con AOP in presenza o meno di altre localizzazioni della malattia aterosclerotica (carotidea e coronaria)
Relativamente alla valutazione dell’espressione di geni potenzialmente coinvolti nella malattia aterosclerotica, pazienti di entrambi i sessi afferenti all’IRCCS San Raffaele Pisana per eseguire accertamenti in merito alla patologia di base sono stati sottoposti anche ad un prelievo ematico per la valutazione di alcuni marker genetici ed in particolare: gene dell ACE (mutazione DD, ID o II), gene MHTFR (mutazione C677T e A1298 C), ApoE (alleli e2,e3,e4). Sono stati valutati 125 pazienti in cui la espressione genica è stata correlata all’ estensione della malattia aterosclerotica (definita sulla base dei dati anamnestici e sullo studio ecografico dell’ asse carotideo, periferico e cardiaco), al grado di obesità, ed ai principali fattori di rischio cardiovascolare.
Sono state evidenziate differenze significative nei livelli plasmatici di interleuchina 6 e PCR nei pazienti con malattia ateromasica stabile rispetto a quelli con malattia instabile ma non sono state evidenziate differenze significative nella espressione genica tra pazienti con localizzazioni differenti della malattia. Sono state evidenziate tuttavia differenze significative di espressione genica tra i pazienti con malattia stabile e quelli con patologia instabile. Pertanto questo studio dimostra che il grado di stabilità clinica della malattia sembra determinare la infiammazione vascolare e la conseguente attivazione genica.

6. Effetto della terapia con Acidi grassi N3 sulla prevenzione della fibrillazione atriale in pazienti cardio-operati sottoposti a cicli di riabilitazione cardiovascolare

L’obiettivo del presente studio consiste nrl verificare l efficacia del trattamento post-operatorio con n-3 acidi grassi polinsaturi nella prevenzione dell'insorgenza della fibrillazione atriale (FA) dopo interventi di cardiochirurgia.
La fibrillazione atriale è la più comune complicanza associata ad interventi di cardiochirurgia, come la rivascolarizzazione miocardica (BPAC), con una incidenza che varia dal 27 al 40%. L insorgenza della fibrillazione atriale post-operatoria comporta un rischio aumentato di ulteriori complicazioni maggiori dopo chirurgia cardiaca, che prolungano la durata della ospedalizzazione e ne aumentano i costi. Sono stati già condotti numerosi studi con l'obiettivo di studiare interventi farmacologici e non farmacologici per la prevenzione di questa aritmia. Studi recenti sperimentali e clinici hanno dimostrato che gli acidi grassi polinsaturi N-3 potrebbero essere efficaci nel prevenire le aritmie cardiache e la morte improvvisa. In particolare, tali sostanze mostrano un significativo effetto antiaritmico in modelli sperimentali su muscolatura atriale di ratto. Inoltre, alte concentrazioni plasmatiche di acidi grassi polinsaturi, derivanti dal consumo alimentare di pesce, si associano ad una bassa incidenza di fibrillazione atriale in uno studio con follow up di 12 anni.
Sono stati inclusi nello studio 169 pazienti. Non sono stati osservati eventi avversi con la terapia con n-3 acidi grassi polinsaturi. L’ analisi dei dati non ha dimostrato alcuna differenza statisticamente significativa nel gruppo di trattamento rispetto al gruppo di controllo nella incidenza di nuovi episodi di fibrillazione atriale e necessità di trattamenti anti-aritmici correlati.

7. Effetto del training fisico sul controllo metabolico in pazienti con aumentato rischio cardiovascolare

Negli ultimi anni si è assistito ad un rapido e progressivo incremento della prevalenza delle malattie cardiovascolari causato, in parte dall'aumento della vita media sia negli uomini che nelle donne, in parte dalle condizioni socio-economiche che hanno favorito la diffusione di uno stile di vita sedentario e l'aumento di patologie quali il diabete di tipo II e l obesità. Diabete ed obesità rappresentano i soli fattori di rischio cardiovascolare ancora in continuo aumento nei paesi industrializzati e non.
Secondo recenti dati ISTAT in Italia la percentuale di individui obesi è aumentata del 25% in 5 anni. L'obesità costituisce uno dei principali fattori di rischio per lo sviluppo di alterazioni del metabolismo glucidico (ridotta tolleranza glucidica, insulino-resistenza), fino alla comparsa del diabete di tipo 2 e delle sue complicanze cardiovascolari . Attualmente il diabete di tipo 2 colpisce dal 3 al 5% della popolazione nei paesi industrializzati e tale percentuale, secondo stime dell'OMS, sembra nei prossimi 10 anni, destinata a raddoppiare in relazione all’aumento percentuale dei soggetti in sovrappeso e/o obesi, non solo nei paesi industrializzati ma anche e soprattutto in quelli in via di sviluppo.
Il diabete di tipo 2 è una malattia cronica caratterizzata da uno stato di iperglicemia, secondario ad una riduzione della secrezione dell'insulina, in presenza o meno di insulino-resistenza. La comparsa del diabete di tipo 2 è determinata non solo da una predisposizione genetica ma anche e soprattutto, dall azione dei fattori ambientali che ne favoriscono l insorgenza. Fra questi l inattività fisica (sedentarietà), divenuta nel corso degli ultimi decenni una caratteristica dominante dello stile di vita delle popolazioni dei paesi occidentali, e regimi alimentari non corretti dal punto di vista nutrizionale, favorendo la comparsa di obesità e di insulino-resistenza, concorrono all esordio della malattia. Pertanto, nonostante il contributo in senso patologico del fattore genetico, la possibilità di interferire con l’azione di questi fattori ambientali reversibili, attraverso una precoce identificazione e cura degli stessi, costituisce un obiettivo prioritario, anche in relazione al maggior rischio cardiovascolare che contraddistingue questi pazienti.
L’associazione dell’ obesità con le alterazioni del metabolismo glucidico e lipidico e l'ipertensione arteriosa concorre a creare il corteo sindromico della sindrome metabolica. La sindrome metabolica rappresenta un importante fattore di rischio per gli eventi cardiovascolari futuri in quanto aumenta in senso moltiplicativo il rischio cardiovascolare associato a ciscun suo componente. Inoltre, nei pazienti con malattie cardiovascolari, la presenza di sindrome metabolica rappresenta un fattore prognostico negativo per eventi cardiovascolari futuri.
Sebbene il rischio di sviluppare la sindrome metabolica sia collegato alle modificazioni dello stile di vita, numerosi studi hanno dimostrato una stretta correlazione tra bassi livelli di ormoni sessuali e sviluppo dei fattori di rischio associati nella sindrome metabolica nei due sessi. Nelle donne la riduzione della produzione degli ormoni sessuali dopo la menopausa si associa ad un aumento del peso corporeo, della pressione arteriosa, della insulino-resistenza.
II trattamento dei pazienti obesi con sindrome metabolica e/o con turbe del metabolismo glucidico deve essere finalizzato, alla perdita di peso, alla prevenzione della progressione delle alterazioni del metabolismo glucidico e di quello lipidico ed alla riduzione del rischio cardiovascolare globale. La perdita di peso di per sé induce un miglioramento della tolleranza glucidica, un miglioramento del profilo lipidico ed un miglior controllo dei valori pressori. In ogni caso, la perdita di peso deve essere associata ad un riequilibrio tra massa magra e massa grassa, e deve essere lenta, graduale e permanente. E’ evidente che tale obiettivo può essere raggiunto e mantenuto non solo modificando le abitudini alimentari del paziente ma anche attraverso un processo educazionale, volto a motivare il paziente a seguire le modifiche dello stile di vita consigliate, al fine di prevenire le conseguenze metaboliche e vascolari associate all’ obesità. Le modifiche dello stile di vita prevedono un regime alimentare controllato e una attività fisica costanti nel tempo. Le calorie introdotte attraverso il cibo devono essere adeguate al consumo calorico e la dieta mediterranea fornisce un esempio di regime alimentare con un equilibrato apporto di nutrienti. L’ attività fisica, che deve essere di tipo aerobico, di lunga durata e di media intensità, accelera il metabolismo muscolare, stimolando il consumo delle energie introdotte con gli alimenti o accumulato come deposito di grasso, migliora i livelli di glicemia e la sensibilità periferica all’ insulina e protrae nel tempo la riduzione del peso corporeo.
Lo studio intende valutare, in popolazioni particolari di pazienti con aumentato rischio cardiovascolare (diabetici, sindrome metabolica, obesi, donne) e/o con malattia coronarica aterosclerotica, di entrambi i sessi, con età compresa fra 40 e 80 anni, l'attuabilità di programmi di fitness metabolico mediante regime alimentare controllato ed esercizio fisico regolare. Si intende inoltre valutare l’efficacia dell'approccio multidisciplinare (regime dietetico, esercizio fisico controllato e continuativo, supporto psicologico, terapia educazionale, terapia medica, etc) sul rischio cardiovascolare globale e su end points surrogati di mortalità e morbidità cardiovascolare.
Lo studio intende inoltre:

Valutare se un regime dietetico e fisico controllato in associazione ad una terapia farmacologica, che migliori la sensibilità insulinica, siano in grado di diminuire la fatica muscolare e di aumentare la capacità funzionale in pazienti obesi con insulino- resistenza;
Valutare se il blocco del sistema renina-angiotensina abbia effetti diretti ed indiretti sul metabolismo glucidico;
Valutare l'efficacia dei programmi di fitness metabolica da sola od in associazione a terapie patogenetiche specifiche sulla progressione della aterosclerosi e sul rischio cardiovascolare globale in pazienti diabetici e/o con sindrome metabolica o malattia aterosclerotica. Valutare in ambo i sessi la importanza della deprivazione degli ormoni sessuali nel determinismo della rischio cardiovascolare globale, della sindrome metabolica, dell obesità e del diabete e l'effetto della terapia di rimpiazzo ormonale sugli end points surrogati di rischio cardiovascolare e sulla probabilità di sviluppare obesità, diabete e rischio cardiovascolare.

8. Valutazione dell'efficacia del training fisico in associazione alla terapia con farmaci sensibilizzanti la sensibilità periferica alla insulina sulla forza muscolare, sul consumo

L'inattività fisica (sedentarietà) è uno dei maggiori fattori causali della malattia diabetica tipo 2 e dell'obesità. Attualmente il diabete tipo 2 colpisce dal 3 al 5% della popolazione sia nei paesi sviluppati che di quelli in via di sviluppo. E' noto che, in genere, tra il manifestarsi della malattia e la sua diagnosi trascorrono almeno 5¸ 10 anni. Per questo motivo si pensa che, allo stato attuale, una stessa percentuale di persone sarebbe affetta da malattia senza esserne a conoscenza.
La malattia è conseguente a fattori genetici con più o meno spiccate componenti ambientali ed è spesso caratterizzata da una concentrazione plasmatica media di insulina essenzialmente normale o anche elevata. Due sono, fino ad oggi, i principali fattori chiave responsabili conosciuti: l'insulino resistenza e l obesità. Su queste due principali cause di diabete tipo 2 l'esercizio fisico produce degli effetti positivi importanti (riduzione della massa adiposa, aumentata sensibilità all'insulina, ecc.). Nonostante il contributo in senso patologico del fattore genetico, il diabete tipo 2 può essere ampiamente prevenuto. Il genoma umano è stato evolutivamente programmato per l'esercizio fisico.
Le cellule dei pazienti diabetici di tipo II sono incapaci di assorbire il glucosio a causa della insulino-resistenza. Le alterazioni metaboliche conseguenti all’insulino-resistenza determinano l'incapacità di ossidare il glucosio. Conseguentemente sia l'insulina che il glucosio si accumulano nel sangue. L insulina determina il metabolismo generale e l'omeostasi energetica mediante l’ interazione centrale e periferica con i recettori insulinici la cui attivazione risulta coinvolta nella regolazione della sensibilità.
L'insulino resistenza consiste in una ridotta risposta dei tessuti periferici (adiposo,epatico, muscolare) all’azione dell insulina che si lega con una minore affinità al suo specifico recettore. Il muscolo scheletrico è stato indicato come il sito più importante di resistenza all'insulina nel diabete tipo 2. L'insulino-resistenza è uno dei fattori chiave responsabile dell'iperglicemia ed è la conseguenza di numerose anormalità metaboliche associate alle malattie cardiovascolari (sindrome da insulino resistenza anche in assenza di diabete conclamato). I meccanismi coinvolti nell'insulino resistenza sono multifattoriali e solo parzialmente compresi. Fra questi risulta particolarmente importante l'aumentata disponibilità degli acidigrassi (sFFA) per i danni da questi provocati a livello del sistema muscolare. Il ruolo degli sFFA nel diabete tipo 2 è particolarmente evidente nei soggetti obesi che hanno diverse anormalità del metabolismo lipidico. L’ esercizio fisico tramite l’ aumentata captazione del glucosio ematico può contribuire nei soggetti con insulino resistenza a migliorare l’ omeostasi glicemica.
In corso di esercizio fisico, specialmente di bassa o moderata intensità il tessuto adiposo provvede a fornire una parte considerevole di substrati al muscolo scheletrico (30¸90%). Durante l'attività fisica di moderata intensità la lipolisi neltessuto adiposo aumenta di due o tre volte rispetto al valore basale. Inoltre, la percentuale di acidi grassi riesterificati nel tessuto adiposo diminuisce e conseguentemente un aumentata quantità di acidi grassi vengono forniti ai muscoli inattività. I principali stimolatori della lipolisi in corso di esercizio fisico sono costituiti da un aumento dell’ attività del sistema nervoso simpatico adrenergico e da una diminuzione della concentrazione di insulina. La sensibilità del tessuto adiposo alla risposta adrenergica aumenta nel corso di una singola seduta di esercizio fisico ed i soggetti allenati, in corso di esercizio, ossidano una maggiore quantità di acidi grassi rispetti ai soggetti sedentari. Gli FFAs sono prodotti durante la lipolisi dei trigliceridi in molti tessuti e fino a tempi recenti non è stato possibile valutare direttamente in corso di esercizio fisico il ruolo relativo dei vari depositi. La quantità delle scorte del tessuto adiposo intraddominale si correla direttamente con l'insulino resistenza ed è considerata un fattore importante nellosviluppo del diabete tipo 2, dell'iperlipemia e dell'ipertensione arteriosa. L'ossidazione generale degli acidi grassi aumenta in risposta all'esercizio e raggiunge il suo picco massimo a circa il 60% della VO2 max. Inoltre, l’ossidazione lipidica aumenta con la durata dell'esercizio caratterizzato da moderata intensità. L’esercizio incrementa lipolisi sia nel tessuto adiposo sia nei muscoli coinvolti nella contrazione, mentre gli FFA plasmatici derivanti dai trigliceridi contribuiscono nel periodo postprandiale solo molto parzialmente al metabolismo dell'esercizio. Le alterazioni metaboliche muscolari nei pazienti diabetici causano una minore efficienza metabolica con conseguente riduzione della forza muscolare ed aumento della fatica muscolare.
L’ ipotesi di studio che si vuole testare con il presente progetto è se la terapia con pioglitazone unitamente ad un programma di esercizio fisico regolare sia in grado di aumentare le performances muscolari e di diminuire la fatica muscolare in pazienti obesi con insulino resistenza.
La popolazione dello studio comprende 75 pazienti obesi (BMI>30) con insulino-resistenza (HOMA-IR >3) e/o diabete mellito non insulino dipendente di nuova diagnosi e non in trattamento con farmaci ipoglicemizzanti.
Lo studio è randomizzato ed ha una durata di 4 mesi per ogni braccio. I pazienti vengono randomizzati in tre gruppi
1. Dieta e training fisico
2. Dieta e pioglitazone
3. Dieta, pioglitazone e training fisico
Finora sono stati arruolati 8 pazienti e screenati 20 a causa della necessità di un adeguato periodo di wash-out dei farmaci insulino-desensibilizzanti attualmente in terapia.
I pazienti reclutati sono stati arruolati secondo il protocollo di sicurezza. Non sono stati osservati eventi aversi durante lo studio.
I pazienti vengono studiati due volte al basale ed alla fine del periodo di trattamento. La dieta è uguale per tutti i pazienti ed a basso contenuto di carboidrati. Il training fisico consiste di una prima fase di esercizi controllati ed una seconda fase di training fisico domiciliare con controllo telemetrico del target di allenamento. Al basale ed alla fine dello studio vengono valutati forza muscolare e fatica. La misurazione della forza muscolare del quadricipite femorale viene effettuata da un trasduttore di forza collegato ad un dinamometro (REV 9000, Techno-Gym) durante massima contrazione volontaria e dopo un periodo di affaticamento determinato da stimolazione elettrica.
Tutti i pazienti sranno sottoposti ad un test da sforzo massimale con misurazione dei gas respiratori
per valutare il consumo massimo di ossigeno e la soglia anaerobica.
Tutti i pazienti sono sottoposti a tests neurovegetativi standardizzati (tilt test, handgrip, deep breathing, misurazione intervallo RR su 600 battiti) per valutare la presenza e l’entità di una neuropatia autonomica.
Al fine di valutare la fatica centrale e periferica e la fatica periferica elettromeccanica viene effettuata in tutti i pazienti una valutazione della fatica centrale mediante la metodica della interpolazione delle risorse contrattili del muscolo striato con valutazione del muscolo tibiale anteriore. Ciascun soggetto esegue una contrazine isometrica massimale del muscolo tibiale anteriore della durata di 40 secondi. Prima ed appena al termine della contrazione vengono erogati con frequenza di uno stimolo ogni 5 secondi, 3-4 stimoli sovramassimali sul nervo motore al fine di valutare le caratteristiche della risposta contrattile e della corrispondente risposta M prima e dopo lo sforzo
Lo studio è stato sospeso a seguito delle recenti pubblicazioni che hanno dimostrato un aumento del rischio di eventi cardiovascolari nei pazienti in terapia con glitazoni.

Scopo del presente studio è valutare l’efficacia di un programma di fitness metabolica in associazione a trattamenti combinato di Calcio antagonista e statina a dosaggio preordinato rispetto alla terapia con ACE-inibitori ed individualizzazione del trattamento lipidico sul rischio cardiovascolare globale, sui markers di infiammazione e sui livelli circolanti di cellule endoteliali progenitrici di base e dopo esercizio in pazienti con sindrome metabolica ed arteriopatia periferica ha dimostrato la superiorità del trattamento con ACE-inibitori e trattamento ipolipemizzante individualizzato rispetto al trattamento con Amlodipina ed Atorvastatina a dosaggi pre-ordinati.
Sono stati inclusi 78 pazienti, 52 uomini e 26 donne con età media di 59 anni valori di pressione arteriosa sistolica 148 mmHg e diastolica 94 mmHg, colesterolo totale 234 mg/dl. La terapia con ACE inibitori combinata alla terapia ipolipemizzante si è dimostrata superiore nel numero di pazienti a target terapeutico, riduzione di valori pressori, riduzione dei valori di colesterolo. L’ACE inibitore utilizzato è il Perindopril a dosaggio di 10 mg.

ACE+Ipolipemizzante Amlodipina5+Atorvastatina10
39 39

Pazienti a target PAS   89%    75%  p<0.05
Pazienti a target PAD   85%    82%  p=NS
Pazienti a target Colest  92%    75%  p<0.05
Pazienti a target LDL col  92%    69%  p<0.02
Proteina C reattiva (mg/dl)  -0.6    -0.2  p<0.05
TNF alfa (pg/ml)   -4    -0.7  p<0.01

Non sono state riscontrate differenze circa la produzione di cellule progenitrici endoteliali dopo trattamento.

10. Influenza del training fisico in associazione a nuove terapie di associazione farmacologica sul metabolismo lipidico in pazienti con sindrome metabolica

E' noto che nei pazienti obesi ed in quelli con diabete di tipo II, sono spesso associate al metabolismo lipidico (alti livelli di trigliceridi e bassi livelli di colesterolo HDL), alterazioni del profilo emocoagulativo ed ipertensione arteriosa. Frequentemente obesità e diabete di tipo 2 coesistono nello stesso paziente con l'ipertensione arteriosa e le turbe del metabolismo lipidico. La associazione dell'obesità con le alterazioni del metabolismo glucidico e lipidico e l'ipertensione arteriosa concorrono a creare il corteo sindromico della sindrome metabolica.
Sia l’esercizio fisico che la dieta e le terapie attualmente disponibili per il trattamento delle alterazioni del metabolismo del colesterolo non permettono sempre di ottenere una normalizzazione del profilo lipidico. E' importante pertanto investigare approcci terapeutici alternativi che possano indurre un miglioramento del profilo lipidico, ed ottenere, quindi, una riduzione del rischio cardiovascolare globale. Sopo del presente studio è quello di valutare l’efficacia della terapia di associazione fissa con Simvastatina ed Ezetimibe al dosaggio rispettivamente di 20 e 10 mg sul profilo lipidico di pazienti con aumentato rischio cardiovascolare.
La popolazione dello studio comprende 75 pazienti di ambo i sessi con aumentato rischio cardiovascolare e sindrome metabolica.
Lo studio è randomizzato bicentrico ed ha una durata di 6 mesi per ogni braccio dello studio. I pazienti vengono randomizzati in tre gruppi:

Dieta e training fisico
Dieta e training fisico e switch da terapia ipocolesterolemizzante con statine a simvastatina/Ezetimibe 20/10
Dieta simvastatina/Ezetimibe 20/10 e training fisico

L’arruolamento dei pazienti è ancora in corso.

11. Predisposizione genetica alle malattie cardiovascolari

L’ ipertensione arteriosa è una patologia che affligge milioni di Europei. Inoltre, nel 90% dei casi la causa dell'ipertensione non può essere determinata e pertanto è definita "essenziale". La predisposizione genetica all'ipertensione essenziale è stata a lungo valutata, a causa della maggior concordanza di pressione arteriosa fra fratelli biologici piuttosto che adottivi. In aggiunta, studi familiari hanno riscontrato che le pressioni sistolica e diastolica hanno un'elevata ereditabilità stimata di 0.57 e di 0.56, rispettivamente. Tuttavia, soltanto poche varianti geniche, che causano forme di ipertensione ad alta penetranza, sono trasmesse in modo chiaramente mendeliano. L'ipertensione inoltre è associata ad un aumentato ispessimento della parete dell’ intima e della media (IMT) dell'arteria carotide, il quale, come l ipertensione, è anch'esso ereditabile.
Numerosi studi condotti su animali ed esseri umani hanno rivelato che i geni importanti per il rilasciamento della cellula del muscolo liscio vascolare contribuiscono direttamente alla contrazione vasale, e le alterazioni dei suddetti geni negli animali di laboratorio sono associati con un aumento dell IMT e ad elevata pressione. Recenti dati molecolari, cellulari ed animali hanno identificato importanti meccanismi che controllano il rilassamento e la contrazione della cellula del muscolo liscio vascolare. In primo luogo, proteine che positivamente (ROCK1, ROCK2) e negativamente (PKGIa, RGS2) modulano il complesso miosina-fosfatasi, regolano direttamente la contrazione cellulare. In secondo luogo, è stato identificato un canale dello ione potassio che controlla la contrazione attraverso la regolazione del potenziale di riposo della cellula muscolare liscia. In aggiunta a questi meccanismi il recettore-alfa degli estrogeni è il principale regolatore di alcune di queste vie, ed i topi ESR2-null presentano l ipertensione. Per comprendere meglio se questi geni siano alla base dell'ipertensione umana sono stati incrociati tutti i loci, considerarti negli studi pubblicati, relativi al linkage dell intero genoma associati all’ ipertensione con i siti dei geni che codificano proteine critiche della via finale comune che media la vasodilatazione.
Vengono ottenuti campioni di sangue e le informazioni cliniche da 1800 soggetti con ipertensione arteriosa distribuiti in 4 nazioni europee ed in Nord America. Il DNA viene purificato dai campioni di sangue allo scopo di svolgere studi genetici. Tutti i campioni e le informazioni cliniche sono de-identificati e le informazioni codificate, non identificanti il soggetto, saranno assegnate ad ogni campione. Il Centro di Ricerca Cardiovascolare dell'IRCCS San Raffaele Pisana effettua la estrazione del DNA per i test genetici dei pazienti inclusi presso l’IRCCS. Tutti i campioni ematici vengono anonimizzati ed indicizzati e nessun campione includerà un contrassegno identificativo.
Per le variabili continue, quale la pressione arteriosa sistolica, viene effettuata l'analisi della varianza per confrontare i punteggi medi fra i tre gruppi genotipici, aggiustando, mediante analisi di covarianza (regressione lineare multipla), eventuali fattori di confondimento delle variabili quali età, genere, fumo di sigaretta, terapia ipocolesterolemizzante, terapia antipertensiva, diabete, livelli di colesterolo totale, HDL e trigliceridi. Analisi supplementari sono effettuate per esaminare modelli di ereditabilità dominante, recessiva, e additiva. In primo luogo, uno studio di screening, usando tutti i polimorfismi, viene svolto per gli endpoints della pressione arteriosa scegliendo come cut off di significatività una P inferiore a 0.1 ed utilizzando un analisi di regressione multivariata. I modelli dominante, recessivo e additivo sono esaminati solo per i polimorfismi genetici che soddisfano il criterio della P<0.1 nel modello generale (3-genotipi). Per esaminare quale allele sia dominante o se gli effetti dei polimorfismi siano additivi, in primo luogo si suppone che l’allele più comune di ogni SNP sia ereditato in modo dominante. A questo scopo, la pressione arteriosa è confrontata fra i genotipi omozigote ed eterozigote per l’allele più comune da una parte, e omozigote per il secondo allele dall'altra parte. Poi, l'allele più comune è assunto come recessivo, ed i risultati sono confrontati fra i portatori omozigoti per l'allele più comune contro i portatori degli altri 2 genotipi. Le analisi statistiche per questo studio sono effettuate usando il software SAS/STAT (SAS Institute, Inc., Cary, North Carolina).
Dimostrare che il polimorfismo di geni importanti per il rilasciamento della muscolatura liscia vasale è associato allo sviluppo di ipertensione arteriosa.
Valutare la occorrenza di varianti geniche e gli aplotipi dei geni che codificano per le proteine che modulano positivamente (ROCK1, ROCK2) e negativamente l’ apparato contrattile ed i canali del potassio che controllano la contrazione delle cellule muscolari lisce vascolari regolandone il potenziale di azione a riposo (BKCa delle sub unità alfa e beta) e le varianti geniche del recettore ß per gli estrogeni.
L’Unità di Biologia Vascolare dell’IRCCS San Raffalele ha contribuito alla realizzazione di tale progetto estraendo finora il DNA dal sangue periferico di 350 pazienti ipertesi. Tale DNA è stato in parte conservato presso la banca biologica dell’IRCCS ed in parte inviato ai laboratori della Tufts University di Boston che effettuerà test genetici sui geni candidati a conferire suscettibilità alla ipertensione e determinerà l’associazione di queste varianti genetiche con la pressione arteriosa.
Lo studio è concluso e si attende il completamento del reclutamento da parte delle controparti europee e statunitensi.

L'arteriopatia obliterante degli arti inferiori (POAD) rappresenta una delle manifestazioni cliniche dell'aterosclerosi la cui prevalenza aumenta con l'aumentare dell'età e con l'esposizione ai fattori di rischio cardiovascolare, primi fra tutti il fumo di sigaretta e il diabete mellito. Dal punto di vista clinico la POAD può decorrere a lungo asintomatica, sia per la elevata tolleranza all'ischemia del muscolo scheletrico, sia per la minor frequenza con cui viene raggiunta, soprattutto nel paziente anziano affetto da comorbidità e/o limitazioni funzionali, la soglia ischemica che causa la claudicatio intermittens, sia per la lenta evoluzione "locale" della malattia, che permette la formazione di circoli collaterali di compenso. Queste caratteristiche cliniche e l'impiego a fini diagnostici di questionari, quali quello di Rose, finalizzati ad indagare la presenza della claudicatio hanno fatto sottostimare la reale importanza epidemiologica e clinica della arteriopatia periferica. Nella popolazione con età maggiore di 65 aa, la prevalenza della POAD dedotta dalla somministrazione del test di Rose risulta essere circa 3 volte inferiore rispetto a quella ottenuta con la rilevazione dell'indice pressorio caviglia/ braccio (ABI) (prevalenza del 7% vs 20% rispettivamente Rose vs ABI). E’ noto che i pazienti con POAD hanno una riduzione dell' aspettativa di vita di circa 10 anni, legata soprattutto alla maggior incidenza di eventi cardiovascolari fatali al follow-up (principalmente dovuti alla cardiopatia ischemica ed in minor misura all'ischemia cerebrale ed alla rottura di un aneurisma).
L’obiettivo di questo studio osservazionale consiste nel verificare l'espressione genica, valutata mediante microarrays, nei pazienti con POADin presenza o meno di altre localizzazioni della malattia aterosclerotica (carotidea e coronarica).
Il reclutamento dei pazienti è stato completato. Non si sono evidenziate differenze significative nel pattern di infiammazione vascolare tra pazienti con diversa localizzazione della malattia ateroma sica. Inoltre non si sono evidenziate differenze di espressione genica tra pazienti con malattia in differenti distretti vascolari.

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di mortalità e morbilità nei paesi occidentali. Il fumo di sigaretta rappresenta un fattore di rischio maggiore per le malattie cardiovascolari ed e una delle principali cause prevenibili di malattia coronarica e morte nei paesi industrializzati. Sebbene l’ evidenza di un legame tra fumo di sigaretta e malattie cardiovascolari sia supportata da un grande numero di studi sperimentali e clinici, non è ancora stato chiarito quali siano i componenti della sigaretta coinvolti ed i meccanismi responsabili di tale associazione.
L’ipotesi dello studio si basa sul fatto che il fumo di sigaretta influenza la funzione endoteliale tramite effetti sulla apoptosi endoteliale e sul numero e funzionalità dei precursori endoteliali. Lo studio si propone di: (a) Valutare l’effetto cronico ed acuto del fumo di sigaretta (nei pazienti fumatori) e della nicotina somministrata mediante uno spray nasale (nei soggetti fumatori e nella popolazione di controllo) sulla funzione endoteliale e sulla elasticità vascolare; (b) Studiare l’effetto del siero di soggetti fumatori su colture in vitro di cellule del sistema cardiovascolare quali HCAEC (cellule endoteliali dell arteria coronarica), cardiomiociti in termini di induzione di apoptosi e produzione di ROS e di maturazione di EPC (cellule progenitrici endoteliali); (c) Valutare l’effetto del siero dei soggetti fumatori e della popolazione di controllo su colture in vitro di HCAEC e cardiomiociti in termini di induzione di apoptosi, di produzione di ROS e di maturazione di EPC, dopo l’esposizione acuta al fumo di una sigaretta (nei soggetti fumatori) e alla esposizione di nicotina somministrata mediante spray nasale (nei soggetti fumatori e nella popolazione di controllo); (d) Valutare il ruolo che l’interazione gene-ambiente (ovvero ApoE-fumo) può avere sulla funzione endoteliale e sulla elasticità vascolare; (e) Valutare la percentuale di EPC nel sangue periferico nei soggetti fumatori rispetto alla popolazione di controllo; (f) Analizzare alcuni marcatori di disfunzione endoteliale (endotelina-1, metalloproteinasi).
I principali risultati attesi sono:

valutazione degli effetti cronici del fumo sulla funzione endoteliale e sulla elasticità vascolare rispetto a una popolazione di non fumatori; valutazione degli effetti della nicotina sulla funzione endoteliale sia nei soggetti fumatori che non fumatori;
correlazione tra le modificazioni del numero di EPC e funzione endoteliale;
correlazione tra potenziale ossidativo del siero del soggetto fumatore e induzione di apoptosi e produzione di radicali nei modelli cellulari cardiomiocita e HCAEC;
correlazione tra siero del soggetto fumatore e la maturazione di EPC da donatori sani;
valutazione di una eventuale alterazione di markers della funzione endoteliale (endotelina-1, metalloproteinasi).

Il reclutamento dello studio la analisi della funzione vascolare e dell’effetto del siero sulla apoptosi sono stati completati. E’ in corso la elaborazione statistica dei risultati.

Nel paziente BPCO la ridotta efficienza dell’attività contrattile diaframmatica, specie in condizioni di iperinsufflazione, si traduce in una riduzione della ventilazione minuto, durante il sonno, maggiore rispetto al soggetto normale. Ne consegue un’alterazione del rapporto ventilazione/perfusione, aumento del volume di chiusura e ipossiemia.
L’obiettivo di questa ricerca è determinare la validità predittiva degli indici di funzionalità respiratoria (FEV1 e FEV1/FVC) nell’individuare, tra i pazienti affetti da BPCO, quelli con aumentato rischio di desaturazioni notturne, indipendentemente dai valori di PaO2 da svegli e dalla presenza di Sindrome delle Apnee Ostruttive (OSAS). Il grado di ostruzione al flusso nelle vie aeree potrebbe altresì costituire un utile test di screening semplice, valido ed economico per selezionare quei pazienti suscettibili di monitoraggio della saturazione ossiemoglobinica notturna e, in presenza di disturbi sonno-correlati, eventuale monitoraggio cardiorespiratorio.
I pazienti reclutati per questo studio sono stati valutati in condizioni di stabilità clinica al fine di escludere le false positività per desaturazioni notturne conseguenti a riacutizzazione della patologia di base (BPCO). Sono stati arruolati un totale di 45 pazienti ricoverati in regime di ricovero ordinario presso l’IRCCS San Raffaele Pisana ed affetti da BPCO. Per ogni paziente sono stati calcolati l’indice di massa corporea BMI (Body Max Index ), il FEV1, il FEV1/FVC (indice di Tiffeneau ), la Pa CO2, la PaO2 e la satO2 media (%). Solo in pazienti selezionati è stato calcolato l’ AHI (Apnoea/Hypoapnoea Index). Sono stati sottoposti ad accertamento mediante monitoraggio cardio respiratorio solamente quei pazienti (7) nei quali esisteva il sospetto di Sindrome delle Apnee Ostruttive nel Sonno.
Lo studio non è ancora concluso e proseguirà nel 2009.

Valutare l’efficacia e gli effetti di un approccio terapeutico combinato farmacologico-riabilitativo su pazienti affetti da BPCO e in particolare sul miglioramento della tolleranza all’esercizio fisico, della Qualità della vita e dei parametri funzionali. Si mira quindi ad identificare il miglior trattamento riabilitativo, ma anche la miglior associazione farmacologia da abbinare ad esso per giungere ad un miglioramento generale dell’approccio al paziente BPCO. In accordo con una recente e rilevante bibliografia e con le linee guida GOLD si è ritenuto individuare all’interno delle classi di farmaci disponibili un’associazione di tiotropio, formoterolo e beclometasone dipropionato.
Sono stati reclutati 46 pazienti; tutti sono stati sottoposti al protocollo riabilitativo della durata di 4 settimane previsto e ad una terapia farmacologia con broncodilatatore per via inalatoria, corticosteroide e anticolinergico. Solo in alcuni casi si è reso necessario il supporto di Ossigeno durante lo sforzo fisico. Sono stati registrati i seguenti dati: MRC pre e post, FEV1% pre e post, 6MWT (distanza percorsa in metri, scala di Borg pre e post), PAPS, Test di broncoreversibilità (FEV1% post-salbutamolo: in entrata e uscita), TLC (pre e post), PO2, PCO2, pH (pre e post), punteggio S. George Questionnaire per pazienti BPCO (pre e post), BODE index (pre e post)
Lo studio è ancora aperto e proseguirà nel 2009.

16. Effetti della riabilitazione pre e post-operatoria in pazienti da sottoporre a chirurgia toracica maggiore

Lo studio si prefigge di valutare gli effetti della Riabilitazione Respiratoria nei pazienti candidati ad intervento di chirurgia toracica maggiore nel pre e post-chirurgico.
Sono stati arruolati 115 pazienti per i quali sono stati valutati: FEVl/min e FEV1% pre e post, 6MWT pre e post ( distanza in metri, SpO2, Borg), BMI e BODE index, Scala MRC della dispnea. Tutti i pazienti reclutati hanno svolto un protocollo riabilitativo di 4 settimane consistente in: utilizzo di incentivatori di flusso e volume, tecniche di umidificazione e disostruzione bronchiale, potenziamento muscolare diaframmatici, potenziamento muscolare degli arti sup. e inf (I settimana 15’ cyclette, II sett.15’ cyclette + 15’ treadmill, III sett. 15’ cyclette + 15’ treadmill + 15’ cicloergometro a manovella.). In 15° giornata dall’intervento chirurgico sono stati impostati un allenamento ed esercizi di mobilizzazione della parete toracica.
Lo studio è ancora aperto, ma ad oggi è stato osservato un miglioramento della tolleranza allo sforzo (aumento della distanza percorsa in metri al 6MWT) e del punteggio della scala di Borg; miglioramento dei valori di FEV1%; miglioramento dei valori di SpO2; miglioramento del punteggio della scala di Borg per la dispnea.

17. Effetti della riabilitazione pre e post-operatoria in pazienti da sottoporre a chirurgia toracica maggiore

L’effetto benefico della Riabilitazione Respiratoria (RR) si esplica essenzialmente sulla riduzione della sintomatologia dispnoica e sull’aumento della tolleranza all’esercizio fisico con conseguente miglioramento della qualità di vita correlata alla malattia. Recentemente è stato sviluppato un nuovo sistema per l’efficace rimozione delle secrezioni bronchiali denominato TPEP (Temporary Positive Expiratory Pressure) che è costituito da una pressione positiva in fase espiratoria temporanea: è cioè attiva per circa due terzi della fase stessa per poi consentire di terminare l’espirazione in maniera spontanea. L’obiettivo del nostro studio è valutare il potenziale sinergismo dell’effetto terapeutico della RR sul danno ventilatorio e sugli indici di valutazione della tolleranza allo sforzo e della sintomatologia dispnoica con l’azione di efficace rimozione delle secrezioni e di miglioramento dei parametri di funzionalità respiratoria e degli scambi gassosi esercitato da un dispositivo multifunzionale che utilizza la tecnologia TPEP(UNIKOR).
Sono stati reclutati ad oggi 21 pazienti affetti da BPCO in fase II, III e IV con componente ipersecretiva e sottoposti ad un ciclo di RR, di ogni età, suddivisi in maniera randomizzata in due gruppi omogenei per quanto riguarda il trattamento riabilitativo proposto ma differenti per quanto riguarda l’utilizzo(GRUPPO A) o meno (GRUPPO B) del sistema TPEP mediante dispositivo multifunzionale UNIKOR. Sono stati valutati all’ingresso ed alla dimissione: quantità delle secrezioni drenate mediante apposita bilancia; Emogasanalisi; Prove di funzionalità respiratoria comprendenti Curva flusso/volume, valutazione dei volumi interni mediante tecnica pletismografica, diffusione alveolo-capillare al CO. Test di reversibilità; 6MWT; BODE index; dispnea mediante scala di BORG e MRC. I pazienti sono stati sottoposti a trattamento riabilitativo secondo un protocollo della durata di 4 settimane. Inoltre i pazienti arruolati sono stati trattati con sistema TPEP che prevedeva l’utilizzo per 30 minuti due volte al giorno di una minima pressione positiva espiratoria temporanea (TPEP: 1 cmH2O).

Lo studio si prefigge di valutare: la percentuale di correlazione tra diagnosi ed il grado di BPCO e disfunzione erettile; l’incidenza e del grado della BPCO in una popolazione maschile, in un range di età compreso tra i 18 ed i 70 anni; il grado di informazione sulla BPCO e sulle possibili modalità di insorgenza; il grado di informazione sulla DE e sulle possibili modalità di insorgenza; la correlazione del grado di BPCO con il tipo e la gravità di disfunzione erettile; la correlazione con eventuali co-morbilità; le correlazioni con lo stile di vita e l’attività lavorativa; le correlazione tra la risposta all’inibitore della 5-PDE e la funzione respiratoria. Altro obiettivo dello studio è quello di svolgere un servizio di educazione sanitaria nell’ambito della BPCO, della DE e delle eventuali co-morbilità
Sono stati arruolati 50 pazienti affetti da BPCO di età compresa tra i 18 e i 70 anni, sottoposti a: emogasanalisi; PFR; analisi di laboratorio (emocromo completo, PSA, ecc.), valutazione dispnea mediante scala MRC; valutazione della qualità di vita mediante somministrazione del St. George Questionare; somministrazione dell’ IISS (International Index Simtomps Score) per la valutazione dei disturbi urinari; somministrazione dell’ IIEF (Indice Internazionale della Funzione Erettile).
Lo studio è ancora aperto e si concluderà a maggio 2009.

20. Riabilitazione neuronale: studio del danno subletale nelle patologie neuronali degenerative e loro riparazione molecolare

La morte cellulare programmata contribuisce a regolare l’omeostasi dei tessuti proliferanti, controllando il rapporto tra cellule replicanti e quelle che muoiono.
Molte malattie neurodegenerative sono determinate dall’attivazione di meccanismi di morte cellulare.
L’ipotesi principale su cui si basa il progetto è che i neuroni siano caratterizzati da un processo apoptotico più lento rispetto a cellule proliferanti. Un neurone funzionale è, infatti, altamente differenziato e quindi l’attivazione della cascata di morte richiede più tempo rispetto a cellule proliferanti. Inoltre nei pazienti che soffrono di malattie neurodegenerative, sebbene i neuroni siano compromessi subito al comparire della malattia, vengono eliminati solo molto tardivamente.
Il progetto si prefigge di:
a) Evidenziare differenze nella cinetica degli eventi apoptotici tra linee neuronali non differenziate e le stesse portate a differenziazione terminale, descriverne i meccanismi e le implicazioni funzionali.
b) Identificare una finestra temporale di danno apoptotico subletale durante la quale, eliminando lo stimolo o inibendo la cascata apoptotica con specifici fattori, si possa bloccare la degradazione cellulare e ottenere un recupero di funzione.
c) Stimolare il recupero molecolare del neurone danneggiato mediante somministrazione di fattori trofici e di sopravvivenza.
La linea cellulare NG108-15 e’ un’ibridoma neuroblastoma/glioma in cui il differenziamento può essere indotto trattando le cellule per 7 giorni con Sodio butirrato 1 mM.
Nei vari esperimenti le cellule sono state trattate con STS 0,5 µM, e con IGF 50 ng/ml.
Il differenziamento delle cellule è stato caratterizzato dal punto di vista morfologico con l’osservazione al microscopio ottico in contrasto di fase.
Per calcolare le percentuali di morte indotta da STS le cellule sono state studiate al citoflurimentro dopo marcatura con ioduro di propidio.
L’analisi dell’espressione delle proteine e’ stata fatta mediante western blotting.
L’attività mitocondriale è stata misurata mediante la sonda JC1 che evidenzia la polarizzazione dei mitocondri. La sonda forma degli aggregati che emettono in fluorescenza colore rosso quando i mitocondri sono polarizzati. Se il mitocondrio e’ depolarizzato tali aggregati non si formano e il JC-1 emette nello spettro del verde.
La microscopia ottica ed elettronica mostra che dopo trattamento delle cellule con sodio butirrato 1mM compaiono neuroni caratterizzati da lunghi assoni e dendriti e da classiche sinapsi chimiche e giunzioni comunicanti.
I neuroni sono stati trattati con staurosporina (STS) 0,5 µM. Le cellule neuronali differenziate con sodio butirrato e le cellule proliferanti sono state trattate per 0, 2, 4, 6, 16,e 24 h con STS 0,5 µM. Dopo il trattamento, le cellule sono state analizzate al citofluorimetro. Dopo 16h di trattamento circa il 95% delle cellule proliferanti muoiono. Mentre solo il 65% delle differenziate muore.
Nelle cellule proliferanti durante il trattamento con STS l’espressione della proteine anti-apototiche Bcl-2 e Bcl-xL a livello mitocondriale diminuisce, mentre la pro-apoptotica Bax aumenta, come atteso. Nei neuroni differenziati ciò non accade.
Nelle cellule non differenziate STS induce danno ai mitocondri, i quali si depolarizzano. Nelle differenziate i mitocondri appaiono ancora energizzati. Il diverso stato di energizzazione dei mitocondri dipende probabilmente da un assetto diverso delle proteine Bcl-2, Bcl-xL e Bax.
Per recuperare la morte indotta da STS nelle cellule differenziate queste sono state trattate contemporaneamente con STS e IGF 50 ng/ml. L’IGF è in grado di diminuire del 20% la morte nei neuroni differenziati indotta da STS dopo 24 h.
Successivamente abbiamo investigato gli effetti dei trattamenti con STS e/o IGF-1 sulla funzionalità delle cellule NG108-15 differenziate. E’ stata esaminata l’eccitabilità cellulare studiando la capacità di generare potenziali d’azione evocati. Il trattamento con STS ha indotto un fenotipo cellulare meno eccitabile: la percentuale di cellule con potenziali d’azione overshooting è diminuita al 60%, e la percentuale di cellule che rispondevano con potenziali d’azione abortivi e’ salita al 40%. Rispetto al controllo, le risposte overshooting delle cellule trattate con STS raggiungono picchi di voltaggio analoghi, mostrano un fronte di salita significativamente più lento.
Per capire se l’effetto della STS era reversibile, sono state lavate le colture trattate con mezzo di controllo per 24 ore prima di eseguire gli esperimenti. Indipendentemente dai trattamenti subiti precedentemente, la percentuale di cellule con risposte overshooting era simile, 80% delle cellule di controllo e 100% delle cellule trattate con STS. Inoltre, rispetto al controllo, le risposte overshooting delle cellule trattate non solo hanno raggiunto un picco simile, ma hanno mostrato anche una velocità di crescita non statisticamente differente.

21. Ruolo delle proteine SIRT nella riabilitazione neuromotoria

Le sirtuine (SIRT) sono una famiglia di proteine estremamente conservate negli eucarioti e coinvolte in molteplici processi cellulari. Un membro di questa famiglia è Sir2, una deacetilasi NAD+dipendente che deacetila gli istoni, influenzando l’espressione genica. E’ stato dimostrato che Sir2 estende la durata della vita in diverse specie, dai lieviti alle mosche. Nei mammiferi esistono sette omologhi di Sir2 (SIR TWO da cui sirtuine), SIRT 1-7. Esse regolano molti aspetti del metabolismo da quello energetico a quello di sintesi varie e, soprattutto, modulano la trascrivibilità della cromatina. Questi geni sono coinvolti nel ritardo dell’invecchiamento e nell’allungamento della durata della vita, attraverso pathways che comprendono l’inibizione o il rallentamento dell’apoptosi, la riparazione molecolare e il mantenimento di cellule post-mitotiche, il reclutamento e la proliferazione di cellule staminali e, infine, proteggendo le cellule da vari tipi di stress.
Un aspetto molto interessante è rappresentato dal fatto che la loro trascrizione viene attivata dalla restrizione calorica e dall’attività fisica. Queste caratteristiche rendono le sirtuine potenziali targets di interventi farmacologici e di attività riabilitative.
SIRT1 diversi substrati: p53, FOXO, PGC-1, Ku70, NF-B, PPAR, p300, CBP, TAF1B, Pol I, HES1, HEY2, PML, MyoD, Tat, e Bcl-6. Diversi studi suggeriscono che SIRT1 influenza la durata della vita e l’invecchiamento attraverso la restrizione calorica. SIRT1 previene anche la morte neuronale e inibisce lo stoccaggio del grasso nei depositi adiposi. La localizzazione subcellulare di SIRT1 è prevalentemente nucleare.
SIRT2 ha localizzazione nucleare e citoplasmatica con prevalenza nel citoplasma, presenta come substrati l’istone H4 e la tubulina Hox10. E’ coinvolta nella regolazione del checkpoint mitotico.
SIRT3 si localizza nella membrana interna dei mitocondri. Il suo substrato è l’acetil-CoA sintetasi. Partecipa alla termogenesi adattativa, riduce il potenziale di membrana e la produzione dei ROS.
SIRT4 è localizzata nei mitocondri ed ha substrato la glutammato deidrogenasi ed e’ coinvolta nel metabolismo del glutammato.
SIRT5 si trova nei mitocondri.
SIRT6 è associata alla cromatina. Nel nucleo deacetila la DNA polimerasi ed è coinvolto nella riparazione del DNA, nell’omeostasi del glucosio e nel mantenimento dei livelli normali di IGF-1.
SIRT7 è associata ai geni trascrizionalmente attivi dell’rRNA nel nucleolo. Il suo substrato è la RNA polimerasi I e gli istoni H2A/B. Promuove la trascrizione dell’rRNA.
Il presente progetto si propone di:
 Analizzare l’espressione delle sirtuine in modelli animali (ratti) e umani (maratoneti, pazienti in riabilitazione cardiaca e neuromotoria). In particolare, come modelli animali sono stati utilizzatiratti tenuti a riposo o sottoposti ad esercizio fisico (corsa fino ad esaurimento); mentre come modelli umani sono stati individuati maratoneti amatoriali e pazienti selezionati e caratterizzati per presenza e assenza di attività di riabilitazione neuromotoria. Verrà valutato se i livelli delle diverse sirtuine (mRNA e proteine) aumentano o diminuiscono nei vari pazienti in funzione della patologia e del protocollo di terapia riabilitativa.

Osservare in vitro l’espressione delle sirtuine nel corso del differenziamento e del recupero da un danno subletale (riabilitazione molecolare o recupero di funzione da un danno reversibile) in linee cellulari muscolari (C2C12) e neuronali (NG108-15 e neuroni primari) sottoposti a un danno.
Osservare se il trattamento con farmaci o molecole anti-ossidanti (resveratrolo), fattori trofici e di sopravvivenza (IGF-1, estrogeni, ecc.) aumenta l’espressione delle sirtuine nelle linee cellulari e, in biopsie di pazienti, quando disponibili.
I ratti sono stati forniti grazie ad una collaborazione con l’università di Lisbona (Portogallo). I ratti sono stati divisi in due gruppi: a riposo e sottoposti ad attività fisica (corsa fino ad esaurimento). I livelli di sirtuine (SIRT 1, 3 e 7) sono stati misurate tramite western blot. I maratoneti sono stati arruolati in collaborazione con il dipartimento di scienze motorie dell’Università di Roma Tor Vergata . I livelli di SIRT 1, 3 e 4 sono stati misurati in questi atleti, prima e dopo maratona su campioni di sangue. I livelli di sirtuine sono stati messi in correlazione con lo stress ossidativo e le proteine apoptotiche.
Saranno arruolati pazienti consecutivi con ictus di tipo ischemico a non più di un mese dall’evento. Per ciascun paziente verranno effettuati prelievi subito prima e subito dopo un’ora di seduta riabilitativa in tre tempi diversi: a tempo 0 (T0), dopo 30 giorni (T30) e dopo 60 giorni (T60) dall’inizio della riabilitazione. Dai prelievi di sangue periferico si otterranno mRNA per analisi in Northen blot e proteine per analisi in Western blot.
La linea cellulare muscolare C2C12 e la linea cellulare neuronale umana NG108-15 verrano usate come modelli cellulari. Queste due linee possono essere cresciute come proliferanti o differenziate. Il danno cellulare sarà indotto con sostanze pro-ossidanti (canferolo ad alta concentrazione), shock osmotico (sorbitolo), shock termico (incubazione a 42°C).
Lo studio dei meccanismi indotti dai trattamenti sopra indicati sarà effettuato mediante western blot, immunoprecipitazione e immunofluorescenza su cellule proliferanti e differenziate.
In particolare ci si focalizzerà sul ruolo delle citoplasmatiche SIRT1 e SIRT2 e delle mitocondriali SIRT3 e SIRT4 associato a degradazione cellulare letale o subletale. L’espressione delle sirtuine sarà misurata in cellule proliferanti e differenziate. Mediante immunoprecipitazione verrà studiata l’interazione tra sirtuine e markers di apoptosi. In particolare l’espressione delle sirtuine sarà messa in relazione al recupero funzionale e morfologico delle cellule in modo da indicare un loro utilizzo come markers di riparazione molecolare.
Risultati sui ratti hanno mostrato una modulazione dell’espressione delle sirutine in seguito a sforzo. Infatti, solo nei ratti sottoposti ad esercizio fisico ad esaurimento è stato osservato un incremento dell’espressione di SIRT 1 e 7 e una diminuzione di SIRT 3.
Risultati sui maratoneti hanno evidenziato una modulazione dell’espressione del mRNA per SIRT1, 3 e 4 che è stata correlata con una diminuzione dello stress ossidativi e del processo apoptotico.
Risultati preliminari ottenuti dal laboratorio di Patologia Cellulare e Molecolare hanno mostrato un ruolo delle sirtuine nella risposta cellulare ad uno stress ossidativo (canferolo ad alta concentrazione), osmotico (sorbitolo) o calorico (incubazione a 42°C). Infatti, tali trattamenti nelle linee cellulari K562, U937 e HeLa inducono morte cellulare con un aumento della sintesi del mRNA di SIRT3 accompagnato da una diminuzione del mRNA di SIRT1. Inoltre è stato osservato che se lo shock osmotico o calorico veniva dato in presenza di un anti-ossidante (canferolo a bassa concentrazione) si osservava una diminuzione del mRNA di SIRT 3, un aumento del mRNA di SIRT1 e una maggiore sopravvivenza cellulare.
Risultati attesi:
1) La riabilitazione neuromotoria induce l’espressione delle sirtuine. Si ipotizza una variazione dell’espressione delle sirtuine (mRNA e proteine) nei pazienti sottoposti a riabilitazione.
2) Caratterizzazione delle sirtuine nei modelli cellulari. Le linee cellulari muscolari e neuronali costituiranno il modello sperimentale dove correlare la presenza del danno con la diminuita espressione delle sirtuine.
3) Il ruolo della famiglia delle sirtuine sarà studiato nel differenziamento e nella sopravvivenza dei miociti scheletrici e dei neuroni. Inoltre potrebbero essere attivate durante il trattamento dei neuroni differenziati con fattori di sopravvivenza.

22. Livelli ridotti di NGF e della proteina TrkA e dell’espressione genica di TrkA nel nervo ottico di ratti con glaucoma indotto sperimentalmente

Il Glaucoma è un malattia dell’occhio caratterizzata da perdita progressiva del campo visivo dovuta a morte delle cellule del ganglio retinico e alla degenerazione delle fibre del nervo ottico. Le neurotrofine, incluso l’NGF, giocano un ruolo predominante sulle cellule del sistema sensoriale e sulle cellule del sistema visivo. Siccome il glaucoma determina gravi danni nelle fibre e nelle cellule del nervo ottico, questo studio ha investigato la risposta dell’NGF e dei suoi recettori in nervi ottici di ratti in cui il glaucoma è stato sperimentalmente indotto.
Lo scopo di questo studio è quello di chiarire il ruolo dell’NGF nel recupero dell’occhio da glaucoma.
L’aumento della pressione intraoculare è stato indotta nell’occhio destro di ratti adulti iniettando soluzione salina ipertonica nella vena superiore episclerale. L’occhio sinistro è stato usato come controllo negativo del glaucoma.
La pressione intraoculare è stata determinata in animali svegli. Tutti i ratti sono stati sacrificati dopo 5 settimane dall’induzione del glaucoma. Retina, globo oculare con nervo ottico sono stati rimossi e usati per studi morfologici immunoistochimici e molecolari. La concentrazione di NGF è stata misurata mediante ELISA.
Analisi istologiche su retina e nervo ottico sono state eseguite con ematossilina-eosina e esaminate al microscopio. L’espressione di TrkA e p75 è stata studiata su sezioni di nervi ottici con glaucoma o di controllo mediante immnuoistochimica, Western Blotting e RT-PCR.
Studi ultrastutturali le sezioni di nervo ottico sono state esaminate al microscopio elettronico.
L’induzione di aumento di pressione oculare riduce la presenza di NGF, dei recettori di NGF e l’espressione di TrkA nel nervo ottico con glaucoma. Mentre nessun cambiamento nell’espressione di p75 viene indotto da aumento di pressione oculare. Questi risultati suggeriscono che NGF e il suo recettore possono essere importanti segnali nella risposta del nervo ottico all’aumento di pressione intraoculare.

23. Degenerazione dei miofilamenti e disfunzione dei cardiomiociti umani nella malattia di Fabry

Il morbo di Fabry è una malattia genetica determinata dalla mancanza dell’enzima -galattosidasi A. Questa malattia è caratterizzata dal progressivo accumulo intracellulare di glicosfingolipidi in numerosi organi, incluso il cuore.
I pazienti con morbo di Fabry presentano un ispessimento progressivo della parete del ventricolo sinistro. Questa condizione mima la cardiomiopatia ipertrofica caratterizzata da disfunzione diastolica del ventricolo sinistro e frazione di eiezione conservata, che può diminuire solo alla fine della malattia. La disfunzione diastolica del ventricolo sinistro è conseguenza, non solo dell’ipertrofia cardiomiocitica e dell’accumulo degli glicosfingolipidi, ma anche di fibrosi miocardica.
Recentemente analisi Doppler hanno evidenziato velocità distolica e sistolica ridotte anche in fasi preipertrofiche, suggerendo un precoce e diretto coinvolgimento della funzione del cardiomiocita.
Questo progetto studia in pazienti con il morbo di Fabry, la composizione proteica dei miofilamenti, la deposizione di collagene del miocardio e l’accumulo di glicosfingolipidi e correla questi parametri con la variazione delle velocità sistolica e diastolica.
Sei uomini con cardiomiopatia da morbo di Fabry non trattato sono stati studiati mediante analisi al Doppler e biopsia endomiocardica del ventricolo sinistro. Le tensioni attive e a riposo sono state misurate prima dopo il trattamento con protein chinasi A in cardiomiociti isolati e permeabilizzati con Triton. Inoltre sono stati anche determinati: 1) le aree dei vacuoli di glicosfingolipidi, 2) la miofibrillolisi, 3) la fibrosi e 4) l’area dei cardiomiociti. Le biopsie delle stenosi mitrali di pazienti con ventricoli sinistri normali sono stati utilizzati come controlli.
La tensione attiva è quattro volte più bassa nei cardiomiociti di pazienti con morbo di Fabry e correla con il grado di miofibrillolisi. La tensione a riposo è sei volte più alta nei pazienti con morbo di Fabry rispetto ai controlli. I trattamenti con proteina chinasi A causano una diminuizione della tensione a riposo ma non influenzano la forza attiva.
L’analisi proteica ha rilevato prodotti di degradazione della troponina I e della desmina.
Le immagini al Doppler evidenziano che le velocità di allungamento e accorciamento sono ridotte in pazienti con morbo di Fabry rispetto ai controlli. Il trattamento con protein chinasi A nei cardiomiciti reverte parzialmente la tensione a riposo. Ciò suggerisce un potenziale beneficio da una terapia sostitutiva enzimatica e/o da agenti che rilasciano energia.

24. Identificazione di marcatori biologici di malattia o di risposta alle terapie in pazienti affetti da Parkinson

Dati presenti in letteratura provenienti da studi condotti su modelli animali e sull’uomo suggeriscono che, durante l’invecchiamento e in alcune malattie ad esso associate (es. malattie di Parkinson e di Alzheimer), la concentrazione plasmatica e tissutale dei tioli proteici e non proteici tende a diminuire. Durante il digiuno, la concentrazione plasmatica di cisteina, infatti, (nella notte e nelle prime ore del mattino, stato post-assorbimento) diminuisce con l’età. Questa diminuzione è associata a una carenza a livello dei tessuti di glutatione, il più importante antiossidante a basso peso molecolare. Inoltre, la carenza di cisteina sembra essere il risultato di una alterazione a livello del processo autofagico di degradazione delle proteine, che normalmente assicura un corretto apporto di amino acidi liberi durante il digiuno. Tali fattori, apparentemente non correlati, sono entrambi regolati dalla via di segnalazione dell’insulina. Infatti, questa via è allo stesso tempo in grado di produrre specie reattive dell’ossigeno e portare a un blocco dell’autofagia. Non solo, la segnalazione dell’insulina può a lungo termine determinare l’inibizione dell’espressione di marcatori di longevità (SIRT1, PGC-1 a) che regolano il metabolismo corporeo, l’omeostasi mitocondriale, i livelli di difesa antiossidante nonché la funzionalità del sistema nervoso ed infine provocare meccanismi di morte redox-regolati. La malattia di Parkinson (PD) è inclusa tra le neurodegenerazioni dell’età avanzata associate a stress ossidativo, alterazione dell’omeostasi redox e morte neuronale redox-regolata. Una delle manifestazioni cliniche di tale patologia è che nel soggetto affetto si può manifestare una repentina perdita della massa corporea ancora del tutto inspiegabile. Dati preliminari dimostrano comunque una diretta associazione tra bassi livelli plasmatici dei tioli non proteici e mancato mantenimento della massa muscolare.
Lo studio si prefigge di indivuare:
- parametri comuni di stress ossidativo
- il pool tiolico proteico e non proteico
Inoltre, altro obiettivo consiste nell’individuare, in modelli in vitro riconducibili al PD, molecole di origine naturale redox-attive in grado di correggere alcuni marcatori molecolari della malattia.
Le analisi ex vivo sono state condotte su campioni di plasma isolati dal sangue venoso di pazienti affetti da PD (n = 20). Il gruppo di pazienti era eterogeneo per sesso, età (compresa tra i 40 e gli 86 anni) ed inizio della malattia. Il sangue venoso, raccolto in provette eparinizzate, era centrifugato e il plasma, presente nel sovranatante, immediatamente deproteinizzato in acido metafosforico (5% finale). La concentrazione di glutatione nella sua forma ridotta (GSH) e ossidata (GSSG) è stata determinata mediante HPLC previa derivatizzazione con acido iodoacetico e reattivo di Sanger su una colonna a scambio ionico. I valori ottenuti sono stati espressi come nmol di glutatione/mg proteine.
Il trattamento con il derivato organosolfurico disolfuro di diallile è stato effettuato alla concentrazione di 50 M per un periodo massimo di 3h su cellule dopaminergiche di neuroblastoma umano (SH-SY5Y). I livelli di fosforilazione di Tau sono stati misurati mediante Western blotting su estratti proteici cellulari avvalendosi dell’uso o di anticorpi che riconoscono Tau indipendentemente dal suo stato di fosforilazione o che riconoscono specificatamente le sue forme defosforilate.
I dati sono stati riportati come media ± D.S. La significatività dei risultati ottenuti è stata valutata mediante analisi della varianza (ANOVA) seguita dal test t di Bonferroni. Valori con p<o.o5 sono stati considerati significativi.
Le prime analisi condotte su campioni di plasma hanno permesso di mettere a punto il sistema di dosaggio della concentrazione di GSH e GSSG. Da queste misure è comunque emerso che entrambe le forme di glutatione sono soggette a variazioni considerevoli sia nell’ambito del gruppo dei controlli sia in quello di pazienti affetti da PD. Data l’eterogeneità dei valori ottenuti, il test statistico non ha potuto rilevare differenze significative tra soggetti di controllo e pazienti. Pertanto, si rende necessaria la raccolta di un numero maggiore di campioni e la classificazione dei pazienti e dei soggetti di controllo per età, sesso e/o tempo di conclamazione della malattia.
Gli studi in vitro condotti grazie all’uso di cellule dopaminergiche di neuroblastoma umano SH-SY5Y hanno rilevato che il trattamento con il composto organosolfurico DADS, estratto dall’Allium sativum, determina una variazione dello stato di fosforilazione della proteina Tau. Tale proteina può trovarsi accumulata nella sua forma iperfosforilata e in questo stato presentare effetti neurotossici. In particolare, abbiamo dimostrato che il DADS è in grado di determinare una completa e repentina defosforilazione di Tau mediata dalla redox-attivazione della protein fosfatasi 1 (PP1). I risultati ottenuti suggeriscono che composti organosolfurici di origine naturale potrebbero essere introdotti nella dieta di pazienti affetti da tauopatie allo scopo di mitigare le alterazioni neurotossiche dello stato fosforilativo di Tau.
Nel secondo anno di ricerca si cercherà di raccogliere un maggior numero di campioni che consentano di valutare se nei pazienti PD esiste un’alterazione del pool tiolico sia nelle cellule del sangue periferico (linfociti, monociti) sia nel plasma. Questi risultati consentirebbero di individuare programmi nutrizionali mirati a correggere le eventuali alterazioni. Inoltre, sarà verificato se esistono delle differenze nello stato redox che sono specifiche per ogni tipo di paziente, cioè che dipendono dal tempo di conclamazione della malattia, dal sesso e dall’età.
Si valuterà in modelli cellulari di tauopatie se il DADS e altre molecole di origine naturale redox-attive siano in grado di ostacolare l’iperfosforilazione di Tau. Si determinerà, infine, su modelli in vitro di PD l’eventuale alterazione del pool di molecole a base tiolica con particolare riguardo al contenuto di cisteina e di glutatione nelle forme di disolfuro misto a proteine.