IRCCS San Raffaele

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L’attività di ricerca dell’IRCCS San Raffaele Pisana è organizzata, all’interno di ciascun Dipartimento, secondo le linee di ricerca previste dal programma di Ricerca Corrente 2006-2009.

Le seguenti ricerche rientrano nella Linea 1 “Riabilitazione Motoria e Sensoriale”:

1. Rapporti fra risultati della ginnastica posturale e personalità premorbosa

2. Il ritorno al lavoro del paziente con ernia del disco

3. I risultati a distanza della idrokinesiterapia dopo artroprotesi

4. I risultati della vibrazione (CRO) nella riabilitazione delle sequele ictali

5. Studio seriale del recupero post-ictale dell'arto superiore

6. Possibile influenza della fede sulla qualità della vita dopo stroke: La fede migliora il vissuto del paziente e la sua qualità della vita dopo stroke acuto?

7. Ruolo dell’ottimismo nel recupero funzionale

8. Tecnologie in Riabilitazione

9. Rapporto tra fenotipo clinico del dolore cefalico, risposta farmacologica acuta ed evoluzione in cronicità

10. Studio dei polimorfismi genetici degli enzimi antiossidanti, del sistema nocicettivo trigeminale, dei meccanismi di inibizione del dolore e della plasticità sinaptica dei circuiti eccitatori ed inibitori in pazienti con cefalea cronica quotidiana

11. Caratterizzazione del motor learning e della plasticità sinaptica dei circuiti eccitatori ed inibitori delle correlazioni clinico-neurofisiologiche-neuroradiologiche in pazienti con lesioni ischemiche encefaliche focali

12. Valutazione dell'outcome del trattamento farmacologico e riabilitativo in un approccio multidisciplinare intensivo nei pazienti con Malattia di Parkinson 

13. Caratterizzazione del ruolo dei recettori metabotropici del glutammato nei processi di sopravvivenza e differenziamento delle cellule ES e NSC in vitro 

14. Miglioramento delle cure nei pazienti con Morbo di Parkinson

15. Ottimizzazione della levodopa

16. La terapia occupazionale nella cura del Morbo di Parkinson

17. Il dolore nel Parkinson: modello sperimentale e studio sull uomo

18. Verso una valutazione non invasiva della disfagia

19. Analisi delle componenti principali per l’estrazione di caratteristiche di un nuvo esame della postura dinamica

20. Farmacocinetica, farmacodinamica e metabolismo di principi biologici attivi e di nuove formulazioni farmacologiche per il trattamento di malattie neurodegenerative e disordini cardiovascolari

21. L’ infiammazione sub-clinica quale fattore emergente nella valutazione del rischio cardiovascolare globale. Studio di marcatori molecolari di diagnosi, progressione, prognosi e risposta alla terapia

22. Identificazione di marcatori molecolari e profili genetici associati alla efficacia della terapia farmacologica in pazienti con patologie neurodegenerative e cardiovascolari sottoposti a riabilitazione motoria e sensoriale

23. Fisiologia e fisiopatologia dell'attività sinaptica nell'uomo. Studio della plasticità cerebrale alla base di efficienti processi cognitivo-motori 

24. Caratterizzazione funzionale e approcci terapeutici a patologie umane causate da mutazioni in recettori nicotinici

25. Studio funzionale di recettori di membrana da pazienti di Alzheimer

26. Ruolo della DNA-dependent protein kinase nella degenerazione neuronale e nella plasticità sinaptica

27. Ruolo dell'alterazione della funzionalità nucleolare nella patogenesi della malattia di Alzheimer

28. Malattia Niemann-Pick di tipo C: identificazione di biomarcatori periferici e sviluppo di nuovi approcci terapeutici basati sulla modulazione dei lipidi di membrana

29. Identificazione di marcatori biologici della sclerosi laterale amiotrofica

30. Studio dei meccanismi fisiopatologici della malattia di Parkinson:valutazione di terapie innovative in modelli sperimentali

1. Rapporti fra risultati della ginnastica posturale e personalità premorbosa  

Il dolore non è solo una realtà fisica, ma è un apprezzamento psicofisiologico che risente molto della peronalità di base. E’ quindi importante esaminare il soggetto portatore di Low-Back-Pain, malattia che riduce la partecipazione e le giornate di lavoro.
Il presente lavoro si prefigge di identificare i soggetti con tratti della personalità rigidi e insofferenti al dolore, fornire counseling, migliorare l’aspettativa e rafforzare il controllo interno.
Sono stati esaminati 20 pazienti con consecutivi Low Back Pain (LBP). I pazienti sono stati valutati con esame neurologico e clinico completo, per l’esclusione di patologie sistemiche o tumorali. A tutti sono stati somministrati il  Minnesota Personality Inventory (MMPI), la scala VAS e la scala Oswestry (attività della vita quotidiana per i disturbi della colonna), la scala di controllo del tronco e il Motricity Index.
L’esame dei profili al test Minnesota indica che il dolore e la disabilità sono collegati a personalità con picco nell’asse dell’isteria, dell’ipocondria e della scala sociale. Sono spesso soggetti con recriminazioni, conflittualità ambientali e bisogno di essere rassicurati. In nessun paziente si è riscontrata la simulazione, anche se sono i pazienti più lenti a riprendere il lavoro.

2. Il ritorno al lavoro del paziente con ernia del disco

3. I risultati a distanza della idrokinesiterapia dopo artroprotesi

L’idroterapia è indicata in molti casi, come nella riabilitazione ortopedica, che sfrutta le proprietà fisiche dell’acqua per accelerare il recupero in condizioni di scarico corporeo. I movimenti sono più regolari e bilanciati, la zona operata è protetta e la muscolatura si rinforza. La pressione sull’area operata favorisce il drenaggio linfatico. Infine, i pazienti provano senso di sicurezza, piacere e  gratificazione, osservando la restituzione del movimento nel mezzo fluido.
Lo studio si prefigge di valutare la idrokinesiterapia nell’outcome riabilitativo dopo artroprotesi di anca (THA) e ginocchio (TKA).
Il cammino del paziente è monitorato da telecamere subacquee che registrano a turno l’immagine su nastro magnetico professionale. La presenza di un orologio digitale che conta anche i “frames” permette nel replay con effetto moviola di stabilire la durata, la lunghezza del passo, la frequenza e la velocità. L’ambiente comprende un percorso a ferro di cavallo, lungo 12 metri e con apertura effettiva di 1,5 metri, più camera di pompaggio, spogliatoi, docce e WC. Un vano intermedio posto 135 cm sotto il pavimento permette al terapista di scendere e osservare direttamente il passo attraverso grandi vetrate. La velocità dell’acqua può essere regolata in modo da offrire o meno resistenza. Possibile anche l’idromassaggio.  Per la sicurezza del paziente sono installate:
a) mancorrenti in acciaio inossidabile
b) un sistema di sollevamento e imbracatura del paziente per evitargli gli scalini iniziali.
c) lampade subacquee per illuminare il percorso.
Sulla parete vi sono un grande monitor digitale TV e altoparlanti per trasmettere musica adatta al mezzo acquatico. L’acqua occupa una superficie di 21 metri quadrati, un volume di 21 metri cubi, la profondità costante di 1 metro, la filtrazione massima di 15 metri cubi/ora con ciclo di 90 minuti. Il riscaldamento può raggiungere fino a 40.000 kcal/ora. La temperatura è in genere mantenuta fra 30 e 32 gradi Celsius. Gli “skimmers” aspirano acqua ad una velocità inferiore a 2 metri/secondo. Si usa cloro per la purificazione (0.4 - 0.8 p.p.m.), che viene eliminato durante il drenaggio. Il pH è 7.2 - 7.6. Il costo dell’opera è inferiore del 30% ai prodotti commerciali, limitati al semplice camminamento e privi degli importanti accessori, come ad esempio le telecamere subacquee.
Viene impiegata la scala WOMAC, il Gold Standard in materia di anca e ginocchio. Essa è una scala ordinale che misura la rigidità, il dolore e la funzionalità.
Lo studio prospettico randomizzato è stato effettuato con 70 pazienti ricoverati per THA con protesi recente.  Dopo randomizzazione, 33 di loro sono stati trattati in modo convenzionale (NHTG) e 31 con idrokinesiterapia (HTG)..
Sono stati inseriti nello studio prospettico randomizzato 70 pazienti ricoverati per TKA con protesi recente. Dopo randomizzazione, 30 di loro sono trattati in modo convenzionale (NHTG) e 28 con idrokinesiterapia (HTG).
Sia per i pazienti con THA che per i pazienti con  TKA, la scala Western-Ontario MacMasters Universities Osteoarthritis Index (WOMAC™) è stata applicata all’ingresso, alla dimissione e 6 mesi dopo. Per l’ analisi statistica sono stai utilizzati i test Kruskal-Wallis, Mann-Whitney and Wilcoxon.
Relativamente ai pazienti con THA, è emerso un miglioramento. Rigidità, dolore e funzionalità sono state tutte positivamente influenzate. L’analisi statistica ha indicato che le sotto-scale WOMAC avevano valori significativamente inferiori per tutti i pazienti trattati con HT. I benefici alla dimissione erano ancora presenti dopo 6 mesi. 
Relativamente ai pazienti con TKA, anche in questo caso, i valori alle sotto -scale WOMAC erano tutti modificati  in senso positivo. L’analisi statistica ha  indicato che i punteggi delle 3  sotto-scale erano  significativamente minori per HTG. I benefici ottenuti al tempo della dimissione si rilevavano ancora 6 mesi dopo. 
Da questo studio emerge che la HT, in una popolazione geriatria, è consigliabile sia dopo THA che dopo TKA.

4. I risultati della vibrazione (CRO) nella riabilitazione delle sequele ictali

La tecnica della vibrazione ha un modello neurofisiologico. Questa applicazione stimola nell'uomo il riflesso monosinaptico come lo stiramento degli avvolgimenti anulospirali dei fusi neuromuscolari ("nuclear bags" e "nuclear chains") che dà luogo a una scarica afferente lungo le fibre di gruppo Ia  fino ai motoneuroni spinali. Questa risposta riflessa è affine allo stiramento meccanico del tendine del muscolo come nel caso del martelletto neurologico, ma è diversa, perchè mentre il martelletto dà uno stiramento istantaneo, il vibratore stira il muscolo per un tempo molto lungo. Per essere efficace la vibrazione deve avere una frequenza di 100-200 Hz con ampiezza di 1-2 mm e un tempo di applicazione non superiore a  2 minuti per evitare disagi da calore locale e frizione. In genere, lo stimolo è portato a livello del tendine o della giunzione muscolo-tendinea. Dopo la prima applicazione resta nel muscolo uno stato di facilitazione, che fa sviluppare tensione ancor maggiore alla seconda applicazione. Questo tipo di risposta meccano-muscolare è chiamata "riflesso tonico vibratorio" ed è posseduta da tutti i muscoli del corpo. L'applicazione alla riabilitazione nasce da considerazioni neurofisiologiche: la stimolazione delle fibre afferenti di tipo Ia eccita i motoneuroni omologhi monosinapticamente  ("stretch reflex" o contrazione del muscolo al suo stiramento), facilita i motoneuroni sinergici agonisti, senza scaricarli, ma preparandoli ad un'eventuale scarica e inibisce i motoneuroni antagonisti. La vibrazione portata erroneamente su un muscolo che ha la tendenza  alla spasticità peggiorerebbe il quadro, inducendo più contrazione, e farebbe scaricare i motoneuroni agonisti sinergici, che nel caso di lesioni cerebrali sono facilitati. Invece, grazie al gioco dell'innervazione reciproca, la stimolazione delle fibre afferenti Ia porta anche all'inibizione del muscolo antagonista; se questo antagonista è ipertonico, l'inibizione avrà valore terapeutico. Ad esempio, in un paziente spastico con sinergia flessoria all'arto superiore, la vibrazione a livello del tricipite, muscolo antagonista, si tradurrà in una riduzione della spasticità. Si ritiene che gli effetti persistano per 30 minuti dopo la cessazione della vibrazione. La tecnica della vibrazione non viene usata da sola, ma sempre in associazione con le altre manovre di fisioterapia, che consentono un orientamento del movimento, reso peraltro più facile dalla migliorata sensazione della contrazione muscolare da parte del paziente. La vibrazione in sede inidonea può indurre clono. L’attivazione fisiologica delle afferenti corticali può giocare un ruolo importante nella riorganizzazione delle aree corticali adiacenti alla lesione ictale. La vibrazione focale è uno stimolo in grado di indurre modificazioni plastiche nel controllo motorio dei distretti trattati.
Lo studio si propone di verificare se, nei pazienti con ictus cerebrale, il trattamento con vibrazione meccanica ripetitiva, selettiva per le fibre afferenti di tipo Ia a livello dei muscoli paretici, possa ridurre la spasticita’, determinare un miglioramento a lungo termine del controllo motorio e della coordinazione e quindi interagire positivamente con il trattamento riabilitativo.
Sono stati inclusi nello studio 20 pazienti con emiparesi da ictus cerebri. Tutti i pazienti avevano un punteggio alla NIH Stroke scale < 25, almeno una minima attività motoria residua a livello degli arti trattati (MRC scale > 1). Quattordici sono stati trattati con vibrazione muscolare ripetitiva (rMV) per 90 minuti per 3 giorni consecutivi (frequenza 100 Hz, bassa ampiezza), dopo 30-40 giorni dall’evento cerebrovascolare acuto. Sei pazienti sono stati trattati con placebo (terapia strumentale inefficace). Tutti i soggetti sono stati infine trattati con fisiokinesiterapia convenzionale. I pazienti sono stati valutati al baseline e successivamente al trattamento con le seguenti scale cliniche:  Ashworth Scale, Rankin Scale, NIH Stroke scale, Barthel Index. In alcuni casi e’ stata eseguita la Gait Analysis.
I dati sono in corso di analisi, ma è possibile anticipare che la spasticità si riduce nel 70% dei casi.

5. Studio seriale del recupero post-ictale dell'arto superiore

Studi epidemiologici condotti su ampie popolazioni, hanno evidenziato una alta incidenza di deficit motori in pazienti con esiti di ictus cerebrale. In letteratura sono descritti diversi strumenti per la valutazione delle funzioni motorie. Per quanto riguarda l’arto inferiore precedenti ricerche, condotte presso il Dipartimento di Scienze Neurologiche, Motorie e Sensoriali, hanno individuato una metodologia basata su un sistema optocinetico che consente di valutare con precisione la performance motoria e di metterne in evidenza anche lievi modificazioni nel corso del training riabilitativo. La valutazione della performance dell’arto superiore è molto più complessa; infatti nessun gesto da solo può dare un’idea della qualità del recupero. Le scale di misura utilizzate in riabilitazione sono generiche e affette da ampi margini di errore. Di recente è stata validata la scala di Wolf , costituita da una serie di semplici azioni che costituiscono gesti incorporati in azioni della vita quotidiana. Al momento non è nota la validità del test di Wolf in ambito riabilitativo.
Obiettivo principale della ricerca è la formalizzazione della curva di recupero dell’arto superiore dal lato plegico con ottima risoluzione temporale. Si prevede di somministrare la scala di Wolf a pazienti emiplegici settimanalmente, per almeno due mesi, al fine di ottenere dati che consentano una valutazione statistica del trend di recupero funzionale. I soggetti inclusi nella sperimentazione seguono un ciclo di riabilitazione standard per la patologia e, se possibile, saranno richiamati per un controllo a sei mesi. L’individuazione di una metodologia di valutazione della performance dell’arto superiore plegico, atta anche a mostrare modificazioni nel corso del tempo, è di notevole interesse in neuroriabilitazione in quanto consentirebbe una valutazione quantitativa dell’efficacia di protocolli riabilitativi. Applicata nel lungo tempo potrebbe essere una strumento di studio del recupero spontaneo o, comunque, dell’evoluzione della patologia anche in relazione a fattori socio-economici e di comorbilità.
Sono stati reclutati 5 uomini e 5 donne con ictus, con età media di 67 anni (ds 11). L’ictus era sia ischemico che emorragico. Tutti pazienti sono stati inseriti in un programma di  riabilitazione, di tipo tradizionale con l’apporto della terapia occupazionale. Tutti i pazienti sono stati sottoposti a esame clinico completo, laboratorio, TAC o RMN. La scala Wolf è stata effettuata da un fisioterapsta non coinvolto nel trattamento.
I dati del Wolf Motor Function Test mostrano un un netto miglioramento della prestazione dopo 2 mesi nei compiti di relativa facilità. Cronometrando i tempi si osserva che al miglioramento delle attività funzionali corrisponde riduzione dei tempi di esecuzione delle attività e un incremento del carico sopportabile. 

6. Possibile influenza della fede sulla qualità della vita dopo stroke:  La fede migliora il vissuto del paziente e la sua qualità della vita dopo stroke acuto?

Molte persone quando si trovano a dover affrontare degli eventi particolarmente stressanti ricorrono
alle loro fonti religiose interne. La religione, e quindi la fede, conferiscono, alle persone che si trovano ad affrontare una crisi, una forza particolare.
Con la Royal Free Interview ci si propone di stabilire se le credenze religiose, spirituali o filosofiche possono essere misurate in maniera empirica in pazienti accettati negli ospedali con una patologia fisica acuta e se queste credenze hanno qualche influenza sul modo di affrontare la patologia stessa e quindi influenzare la Qualità della Vita. Il processo di “coping” da parte della persona colpita da stroke non è stato mai considerato, ma uno studio precedente del gruppo ha dimostrato che la Fede tampona la depressione post-ictale (Giaquinto S, Spiridigliozzi C, Caracciolo B.  Can faith protect from emotional distress after stroke? Stroke. 2007 Mar;38(3):993-7. Epub 2007 Feb 15). Se la Depressione dopo Stroke ostacola il recupero e la fede riduce la depressione dopo Stroke, si può desumere che la fede migliori il recupero. Il presente progetto si propone di valutare il coping religioso ai fini dell’outcome riabilitativo.
Sono stati arruolati 112 pazienti consecutivi e sono stati raccolti i dati dei test-retest. A tutti i partecipanti è stata somministrat la Royal Free Interview (RFI), una intervista semi-strutturata per il sentimento religioso e spirituale. Il tono dell’umore è stato valutato con la Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS). Lo stato funzionale è stato misurato con la scala Functional Independence Measure (FIM). La relazione  fra sentimento religioso e spirituale, tono dell’umore e la radice quadrata del recupero funzionale è stata esplorata mediante la  regressione lineare.
Le conclusioni preliminari indicano che il risultato del recupero funzionale dipende soprattutto dal grado di indipendenza all’ingresso (migliore la FIM di ingresso, migliore la FIM di uscita). Il sentimento religioso e spirituale non sembra influenzare il processo di riparazione, che è prevalentemente biologico.

7. Ruolo dell’ottimismo nel recupero funzionale

Gli effetti dell’ottimismo sulla salute fisica sono ben noti; recenti studi sperimentali mostrano che chi è ottimista si ammala significativamente meno e vive più a lungo rispetto a chi non lo è. Da tali ricerche è emerso, ad esempio, che nel caso di osteoartrite con dolore al ginocchio (Gretchen B. et al.) i soggetti pessimisti presentano, rispetto agli ottimisti, un peggioramento generale della motilità (camminare, salire le scale, entrare ed uscire dall’auto); altre ricerche evidenziano come l’ottimismo favorisca la salute dell’apparato circolatorio e diminuisca lo stress-postoperatorio in caso di intervento chirurgico per by-passcoronarico. Bijn-Jun S. Et al (2004) hanno dimostrato che l’ottimismo ed il sostegno sono predittori di una buona aderenza e buon esito del trattamento riabilitativo. La presente ricerca si propone di verificare se l’ottimismo (inteso come tratto disposizionale nella regolazione delle aspettative circa gli eventi futuri) influenza la percezione della qualità della vita, il tono dell’umore e il recupero funzionale di pazienti affetti da malattia di Parkinson che effettuano riabilitazione neuromotoria in regime di Day Hospital.
L'obiettivo generale della presente ricerca consiste nel verificare il grado di influenza esercitato dall'ottimismo sul benessere soggettivo e sulla capacità di far fronte alle emozioni. Vanno intesi come ottimisti coloro che si aspettano esiti positivi, anche quando le condizioni sono negative; per contro, vanno considerati come pessimisti coloro che si aspettano risultati negativi, anche quando le condizioni non sono sfavorevoli. L'ottimismo così concepito rappresenta un fattore non secondario di promozione del benessere soggettivo e della capacità di gestione delle emozioni. L’ipotesi di lavoro prevede che i soggetti ottimisti siano maggiormente in grado di gestire la propria malattia ed il percorso riabilitativo. Nello specifico si ipotizza che i soggetti ottimisti avranno, rispetto ai pessimisti, una migliore percezione della qualità della vita, un minor disturbo dell’umore e un miglior recupero funzionale al termine del ciclo riabilitativo. Obiettivo principale è il miglioramento del coping in pazienti con malattia di Parkinson. Sono stati arruolati presso il Day Hospital del San Raffaele Pisana 70 pazienti, di cui 16 esclusi (7 con MMSE<24, 8 drop-outs, 1 non collaborante). L’analisi dei dati è stata eseguita su 46 uomini e 24 donne. Età media: anni 68 (d,s. 10). La gravità della malattia all’ingresso è stata valutata con la scala UPDRS che dava il valore 35. Sono state applicate le scale WHO-5 per la Qualità della Vita, LOT-R dell’ottimismo, HADS per la depressione. Dallo studio è emerso un miglioramento alla dimissione sui valori dei questionari somministrati in ingresso. L’analisi statistica con modello logistico è attualmente in corso per verificare se le persone ottimiste all’ingresso hanno mostrino maggior recupero funzionale.

 8. Tecnologie in Riabilitazione

 9. Rapporto tra fenotipo clinico del dolore cefalico, risposta farmacologica acuta ed evoluzione in cronicità

Il presente progetto intende verificare se la terapia acuta dell’attacco con rizatriptan 10 mg in emicranici con segni di attivazione RTA sia in grado di fornire una riduzione dell’esposizione all’attacco nei pazienti, migliorandone le misure di outcome sia a breve (qualità di vita) che a lungo termine (evoluzione in cronicità).
E’ stato eseguito lo screening ed il reclutamento di 80 pazienti affetti da emicrania senza aura o con aura da almeno 1 anno con frequenza di attacchi compresa tra 1 e 8 al mese nei 2 mesi precedenti. Lo studio, randomizzato, in doppio cieco, controllato verso placebo, a gruppi paralleli, valuta l’ efficacia di rizatriptan 10 mg FDT nel trattamento dell’attacco acuto di emicrania in pazienti con segni di attivazione del RTA. I pazienti arruolati sono assegnati in maniera randomizzata (rapporto 1:1) al gruppo di trattamento attivo (rizatriptan 10 mg RPD) o al gruppo placebo. Il farmaco deve essere assunto non appena il paziente avverta un dolore emicranico di intensità moderata o severa (grado 2 o 3). Nel corso delle 48 ore successive alla assunzione della dose iniziale del farmaco in studio i pazienti registrano su apposita carta diario, ad intervalli di tempo predeterminati, i seguenti parametri:1) intensità del dolore; 2) presenza o assenza dei sintomi di accompagnamento; 3) grado di disabilità funzionale; 4) uso di farmaci di emergenza nonché 5) nei casi con recidiva dell’attacco, inizio ed intensità del primo riapparire di cefalea di intensità moderata o severa. Gli eventi avversi vengono registrati nella carta diario e valutati sulla base della intensità in lievi, moderati o severi.
Nella seconda parte dello studio è valutato in maniera retrospettiva il valore predittivo per una evoluzione verso la cronicità di sintomi relativi alla attivazione del RTA e/o di allodinia cutanea cefalica in soggetti con emicrania episodica. Sono stati reclutati 106 pazienti consecutivi affetti da cefalea cronica quotidiana (emicrania cronica + cefalea da abuso di analgesici), M/F: 8/98, età media 46.4 + 13.4,  durata di malattia 26.8 + 13.8. Il 32% dei suddetti  pazienti presentava UAs, il 40% allodinia cutanea. Pertanto tali dati tendono a suggerire che non solo la frequenza degli attacchi ma anche la durata dell’esposizione al singolo attacco emicranico sia un elemento cruciale per la comparsa di lesioni strutturali vascolari ed ossidative e quindi per la evoluzione del dolore verso la cronicità.
Il risultato atteso è che il trattamento con rizatriptan in tale tipologia di pazienti emicranici comporti: 1) una maggiore percentuale di pazienti con risoluzione dell’attacco emicranico a 2 ore dall’assunzione; 2) una più rapida comparsa dell’azione terapeutica rispetto ai pazienti emicranici senza segni di attivazione del RTA.

10. Studio dei polimorfismi genetici degli enzimi antiossidanti, del sistema nocicettivo trigeminale, dei meccanismi di inibizione del dolore e della plasticità sinaptica dei circuiti eccitatori ed inibitori in pazienti con cefalea cronica quotidiana

Lo studio si prefigge di approfondire le conoscenze sulla patogenesi dell’emicrania e di  identificare i marcatori biologici e neurofisiologici attraverso studi genetici e neurofisiologici in pazienti con forme episodiche e croniche.
Sono stati valutati 168 pazienti consecutivi affetti da emicrania con o senza aura e da cefalea cronica quotidiana (CDH). Tutti i pazienti sono stati sottoposti a visita neurologica e ad una valutazione dell’emicrania attraverso un questionario semistrutturato. 
Sono stati raccolti 72 campioni di pazienti con emicrania senza aura, 97 di pazienti con CDH e  67 di soggetti sani di controllo per valutare se specifici polimorfismi dei geni che codificano per enzimi antiossidanti e proteine coinvolte nei pathways di riparazione possano essere causa di ridotta resistenza allo stress ossidativo risultante dal reiterarsi degli attacchi.(CAT, SOD, NOS2A). Sono stati valutati inoltre i polimorfismi dei seguenti geni: ACE (Angiotensin Convertine Enzyme) I/D, DBH (Dopamine Beta Hydroxylase) I/D, GNAS (Guanine Nucleotide-binding protein, Alpha-stimulating activity polipeptide 1) 393T>C, HFE (hemochromatosis) 187C>G, KCNJ10 (Potassium Channel, Inwardly Rectifying, Subfamily J, member 10) 961T>C, LTA (Lymphotoxin-alpha) -294C>T e -293A>G , MEP1A (Meprin, alpha subunit) -20A>T, MMP3 (Metalloproteinase 3) -1171 5A>6A, NOTCH3 (Notch, Drosophila, homolog of, 3) 684G>A, PGR (Progesterone Receptor) IVS3 G>T e RHAG (Rhesus Blood Group-Associated Glycoprotein) 507G>T.
Risultati preliminari mostrano una correlazione statistica significativa tra emicrania e polimorfismi DBH, GNAS e RHAG, in accordo con la legge di Hardy-Weinberg. Gli studi di laboratorio e di valutazione statistica su altri probabili polimorfismi genetici (CAT, SOD, NOS2A) sono in corso.
Il  diffuse noxious inhibitory control (DNIC), definito come “ autocontrollo del dolore” è stato studiato in 10 pazienti con cefalea cronica quotidiana. Lo studio funzionale del sistema nocicettivo è stato eseguito mediante la registrazione di potenziali evocati laser effettuati dopo stimolazione dolorifica della regione perilabiale inferiore sia destra che sinistra ad intensità dolorosa (per valutare la risposta corticale attraverso l’attivazione delle fibre A) e ad intensità calorica non dolorosa (per valutare la risposta attraverso l’attivazione delle fibre C termiche).
I risultati ottenuti mostrano una inibizione del potenziale corticale N2/P2 ottenuta attraverso la stimolazione sia delle fibre A che delle fibre C della regione perilabiale destra durante e dopo l’applicazione della crema di capsaicina sulla medesima regione; al contrario mentre il potenziale corticale evocato dalla stimolazione delle fibre A della regione controlaterale all’applicazione della capsaicina risulta ridotto in ampiezza, il potenziale legato all’attivazione delle fibre C si evoca con la medesima ampiezza sia durante l’applicazione della crema, sia dopo. Attualmente è in corso la registrazione dei LEPs nei soggetti normali di controllo.
In 46 pazienti emicranici con e senza sintomi di attivazione del riflesso autonomico-trigeminale, sono stati effettuati: blink reflex, Aδ LEPs e C-LEPs. Lo studio del blink reflex e del riflesso masseterino inclusi i riflessi trigeminali. I LEPs sono stati effettuati mediante uno stimolatore laser Nd:YAP. L’analisi ad interim ha mostrato una differenza significativa nell’ampiezza dei C-LEP nei pazienti emicranici con e senza attivazione del riflesso autonomico (P=0.03).
E’ stato studiato l’effetto della Stimolazione Ripetitiva Transcranica (rTMS) dell’area motoria sinistra sull’ampiezza del MEP durante un treno di stimoli (frequenza: 5Hz; intensità: sopra-soglia) in 19 pazienti con emicrania con aura, in 19 pazienti con emicrania senza aura e in 19 soggetti sani di controllo, per valutare il processo di plasticità sinaptica dei circuiti inibitori ed eccitatori. L’ analisi ANOVA ha evidenziato una significatività statistica nello “stimolo” durante la sequenza di impulse (p=0.000) ed una interazione tra “stimolo”e “gruppo pazienti” (p=0.00001). La facilitazione del MEP è risultata diversa nei 3 gruppi: più alta nei pazienti con emicrania con aura rispetto ai sani e più bassa nei pazienti con emicrania senza aura.
Alla fine dell’ arruolamento si valuteranno le correlazioni tra frequenza, gravità e durata di malattia con polimorfismi genetici e cambiamenti neurofisiologici.

 11. Caratterizzazione del motor learning e della plasticità sinaptica dei circuiti eccitatori ed inibitori delle correlazioni clinico-neurofisiologiche-neuroradiologiche in pazienti con lesioni ischemiche encefaliche focali

Il presente progetto intende i meccanismi a breve termine della plasticità corticale utilizzando 5-Hz rTMS in pazienti con ictus in aree non motorie e le correlazioni clinico-neurofisiologiche-neuroradiologiche in pazienti con lesioni focali ischemiche a livello del tronco cerebrale.
Sono stati arruolati 40 pazienti ricoverati (range di età 50-80 anni ; M/F = 20/20) nel reparto di Neuroriabilitazione dopo un ictus acuto o subacuto. Tutti i pazienti sono stati sottoposti a RMN encefalo per definire la sede esatta ed il tipo di lesione.
22 pazienti con lesioni ischemiche isolate del tronco cerebrale sono stati sottoposti a potenziali evocati laser (LEPS) (n=13 pz), test vestibolari (n= 6 pz) e riflessi trigeminali (n= 4 pz). 18 pazienti con lesioni ischemiche acute delle aree non motorie sono stati sottoposti a 5-Hz rTMS dell’area motoria dell’emisfero affetto.
Relativamente alla distribuzione delle lesioni è emerso che: mesencefalo (n=3), ponte (n=8); bulbo (n=3); ponto-bulbari (n=2); ponte-mesencefaliche (n=2); ponte + cervelletto (n=2); mesencefalo + cervelletto (n=2). I LEPs erano normali in tutti i pazienti studiati (latenza media del potenziale al vertice N2/P2: latenza 190 ± 10 msec; ampiezza 13,8 ± 8 microV). Due pazienti con lesioni pontine mostravano alterazioni al test di equilibrio (anormale Composite e C5), probabilmente a causa del deficit vestibolo spinale. Non sono state riscontrate alterazioni nei riflessi trigeminali. La rTMS ha dimostrato una riduzione significativa della curva di facilitazione del potenziale evocato motorio (MEP) durante la stimolazione ripetitiva dopo un primo MEP di normale ampiezza.
I LEPs  non hanno messo in luce risultati significativi, mentre la rTMS suggerisce un’alterazione della plasticità a breve termine nella corteccia motoria primaria presumibilmente a causa di un’alterazione delle connessioni intracorticali tra aree non motorie colpite e l’area motoria primaria.
L’arruolamento è in corso solo per la rTMS .

12. Valutazione dell'outcome del trattamento farmacologico e riabilitativo in un approccio multidisciplinare intensivo nei pazienti con Malattia di Parkinson

La malattia di Parkinson (MdP) è conosciuta per i sintomi motori che la caratterizzano (tremore, rigidità, lentezza nel movimento), ma altri sintomi hanno un notevole impatto sulla qualità della vita dei pazienti. Molti di questi sintomi sono non-motori come il dolore, la difficoltà respiratoria, l’ipofonia, i disturbi cognitivi. Nonostante gli sforzi della ricerca, sia in ambito farmacologico che  chirurgico, la MdP rimane una malattia cronica e progressivamente invalidante non solo per quanto riguarda la sua storia naturale, ma anche successivamente all’introduzione della terapia farmacologica. L’importanza di programmi di prevenzione e di contenimento della disabilità costituiscono pertanto una parte di grande rilievo dell'assistenza di questi malati. E’ stato dimostrato che l’esercizio fisico da solo non è sufficiente a ridurre le complicanze, la morbilità e la comorbilità correlata alla malattia. Per tale ragione sono stati sviluppati programmi di riabilitazione multidisciplinare con l’obiettivo di sfruttare il potenziale di recupero del paziente parkinsoniano.
Tale progetto, data la complessità, si articola nei seguenti sottoprogetti:

• Valutazione della funzionalità del sistema nocicettivo in pazienti con dolore cronico affetti da Malattia di Parkinson e dell’influenza del movimento sulla genesi del dolore.
  Il dolore riveste un ruolo importante per frequenza e disabilità correlata, ma rappresenta un aspetto poco studiato ed a patogenesi ancora non chiarite. La prevalenza del sintomo dolore in tali pazienti varia dal 40% al 75% e nel 10-30% dei casi è di difficile l’interpretazione in quanto non può essere correlato a nessuna patologia evidente (“dolore primario parkinsoniano”).
  È valutata la funzionalità del sistema nocicettivo in pazienti affetti da MdP con sindrome dolorosa cronica tramite la metodica dei Potenziali Evocati Laser CO2 (PEL), che consente di studiare in maniera selettiva le fibre della sensibilità dolorifica.
• Valutazione della capacità respiratoria dei pazienti Parkisnoniani e come la riabilitazione respiratoria possa influenzare tale capacità.
  Lo studio si prefigge di definire, caratterizzare e valutare le alterazioni polmonari nei pazienti affetti da Malattia di Parkinson. Nonostante siano stati pubblicati molti studi sulle alterazioni polmonari in questi pazienti, i risultati ottenuti non sono affatto univoci. Sono stati consecutivamente arruolati nello studio 30 pazienti (F 18; M 12; età media 66,33 ± 10,53 aa) con fluttuazioni motorie e non fumatori. La gravità della Malattia di Parkinson è valutata secondo la sezione motoria della scala UPDRS e il punteggio medio rilevato è stato di 54,8±14,9 in OFF e di 21,5±8,7 in ON. Lo stadio della malattia secondo Hoehn and Yahr era: II n = 1;  III n = 19;  IV n = 10.  I pazienti hanno eseguito sia  la rilevazione momentanea dei valori della saturazione ossiemoglobina in aria ambiente due volte al giorno sia la registrazione continuativa notturna mediante pulsossimetro Minolta  con sonda di rilevazione al dito mentre la percezione della dispnea a riposo è stata valutata nella fase motoria ON e OFF utilizzando la scala di Borg modificata in cui 0 indica l’assenza della dispnea e 11 una dispnea intollerabile. I test di funzionalità respiratoria eseguiti dai pazienti in ON ed OFF, comprendono: la curva flusso volume, la valutazione dei volumi polmonari e delle resistenze delle vie aeree mediante pletismografia corporea, la massima pressione inspiratoria.
  La saturazione ossiemoglobinica diurna era normale in tutti i pazienti. Otto dei 30 pazienti (26,6%) non sono riusciti ad eseguire le prove di funzionalità nella fase motoria ON e 10/30 (33,3%) in OFF. I test di funzionalità respiratoria eseguiti in ON hanno evidenziato una sindrome ostruttiva in 2 pazienti su 22 (9,1%), una ostruzione delle piccole vie aeree in 4 pazienti su 22 (18,2%), una sindrome restrittiva in 8 pazienti su 22 (36,4%) e una sindrome mista in 3 pazienti su 22 (13,6%). In 5 pazienti su 22 (22,7%) le prove di funzionalità respiratoria erano normali. Il picco di flusso espiratorio e la massima pressione inspiratoria (MIP) erano inferiori all’80% del valore teorico atteso per età, sesso, peso, altezza e razza in 15 su 22 casi (68,2%). Durante la fase OFF le prove di funzionalità hanno evidenziato una sindrome ostruttiva in 2 pazienti su 20 (10%), una ostruzione delle piccole vie aeree in 3 su 20 (15%), una sindrome restrittiva in 9 su 20 (45%) e una sindrome mista in 4 su 20 (20%) pazienti. In 2 pazienti su 20 (10%) le prove di funzionalità respiratoria erano normali. Il picco di flusso espiratorio era inferiore all’80% del valore teorico in 14 casi su 20  (70%), e la massima pressione inspiratoria in 18/20 (90%). 12 pazienti su 22 pazienti (54,5%) riferivano dispnea a riposo durante la fase ON ( Borg 1 n = 3; Borg 2 n = 6; Borg 3 n = 3) e 18/22 (81,2%) in OFF  (Borg 0,5 n = 1; Borg 1 n = 3; Borg 2 n = 5; Borg 3 n = 3; Borg 4 n = 4). La pulsossimetria notturna in aria ambiente  ha mostrato valori di saturazione ossiemoglobinica < 90% per un periodo di registrazione > 30% del tempo totale del sonno in 1 paziente su 22 (4,5%).
  I dati mostrano che i pazienti affetti da MdP presentano alterazioni della funzionalità respiratoria durante la fase ON in circa il 78% dei casi e nel 90% durante la fase OFF, ma ai ritiene particolarmente interessante che la sindrome restrittiva sia l’alterazione più frequentemente riscontrata sia durante la fase ON che durante la fase OFF (36,4% e 45% rispettivamente) e che la MIP risulti gravemente ridotta nella maggior parte dei pazienti in entrambe le fasi motorie. Il coinvolgimento del diaframma e dei muscoli intercostali e le alterazioni posturali presenti nella MdP possono spiegare questi risultati. La maggiore percezione della dispnea che si registra in fase OFF (80%) potrebbe essere correlata alla rigidità e alla bradicinesia dei muscoli della gabbia toracica, e alla mancata coordinazione dei muscoli inspiratori durante questa fase motoria.
• Valutazione della capacità vocale di questi pazienti e l’effetto di un nuovo programma riabilitativo Foniatrico.
  Il metodo di trattamento della voce Lee Silverman Voice Treatment (LSVT) è stato appositamente studiato e testato per l’adattamento ai problemi delle persone con MdP ed altre malattie neurologiche (PSP, MSA). LSVT® è un trattamento intensivo volto all’aumento dell’intensità vocale, mediante l’incremento della pressione dell’aria sottoglottica per una migliore vibrazione cordale. Il principio della tecnica è espresso dal motto “Think loud, think shout” (pensa ad alta voce pensa a un urlo): lo sforzo fonatorio incrementa il tono dei muscoli laringei e la frequenza della voce. LSVT® migliora sia la voce che l’eloquio degli individui con malattie neurologiche attraverso il trattamento della patologia fisica sottostante associata al disturbo della voce. La terapia si concentra sull’aumento del volume immediatamente trasferito alla comunicazione quotidiana, permettendo ai pazienti di mantenere e/o migliorare la loro comunicazione orale. LSVT® è somministrato con un programma intensivo di 16 sedute individuali in un mese (sedute di un’ora quattro giorni consecutivi alla settimana per quattro settimane). Ogni seduta consiste di ripetizione di compiti simili, come la produzione di “ah” sostenuta alla massima durata e alla massima estensione possibile. L’aumento dell’intensità vocale nell’eloquio spontaneo e il maggiore controllo della sonorità vengono mantenute per un tempo gradualmente più lungo. L’alto sforzo delle funzioni vocali associato al feedback propriocettivo e all’automonitoraggio uditivo-vocale, aiuta i pazienti a rigraduare l’ampiezza dell’uscita motoria del proprio linguaggio e a mantenere il giusto livello durante la conversazione.  Sono stati valutati 12 pazienti affetti da Malattia di Parkinson sottoposti a 16 sedute secondo la metodica di LSVT®, per impostare un miglioramento dell’efficacia respiratoria, con aumento della capacità inspiratoria ed espiratoria, dell’adduzione delle corde vocali, dell’attività e della sinergia dei muscoli laringei, dei movimenti articolatori laringei e sovralaringei.
  I risultati preliminari hanno mostrato in tutti i soggetti un aumento del volume della voce con miglioramento della raucedine, del tremore della voce, dell’ipernasalità, chiarezza dell’eloquio attraverso un aumento dell’ampiezza della voce e dell’intensità vocale. Quindi i disturbi della voce, scarsamente controllati dalla terapia farmacologia, possono realmente beneficiare di metodiche riabilitative intensive specifiche.
• Valutazione delle funzioni cognitive dei pazienti parkinsoniani ed in particolare alle complicanze psichiatriche (allucinazioni, psicosi disturbi del comportamento).
  Nel corso della ricerca i pazienti affetti da Malattia di Parkinson afferenti alle strutture del network San Raffaele sono sottoposti a valutazione psicologica e cognitiva mediante l’utilizzo di scale validate (MMSE, PDQ-39, MIDI). E’ emersa in maniera significativa nel campione analizzato, la numerosità di problematiche di natura comportamentale, legate ad aspetti di disregolazione dopaminergica. Questo aspetto, per importanza numerica ed impatto sociale, ha richiesto un approfondimento dello studio in uno specifico progetto.
   Valutazione del metabolismo nei pazienti con dimagrimento patologico. I pazienti con Malattia di Parkinson vanno incontro a perdita di peso non spiegabile con maggiore attività fisica o cambiamento delle abitudini alimentari. In questo progetto si è intrapreso uno studio per valutare il ruolo della cisteina nel dimagrimento del paziente con Malattia di Parkinson ed il possibile ruolo di un cambiamento dietetico nel recupero. Si è iniziato ad effettuare una caratterizzazione di marcatori biologici periferici tramite screening su campioni di plasma, su linfociti e monociti isolati dal sangue di pazienti, con valutazione del contenuto di cisteina, asparagina e glutammato quali parametri di alterata omeostasi del processo autofagico delle proteine.
   Valutazione del ruolo della riabilitazione multidisciplinare intensiva nell’outcome funzionale.
  Nell’ambito di questo progetto si è focalizzata l’attenzione su due distinti aspetti, e cioè l’analisi della deambulazione (gait analysis 3D-GA) e la musicoterapia. La 3D-GA consente, attraverso l’analisi computerizzata della deambulazione di monitorare il movimento del paziente e di misurare quantitativamente aspetti della deambulazione che diventano fondamentali nella valutazione della sua limitazione funzionale. Si è voluta verificare la validità dell’esame 3D-GA come valutazione clinica quantitativa dell’effetto della levodopa nella MdP. Sono stati reclutati 20 pazienti che hanno effettuato valutazione clinica con scale UPDRS parte III da 2 operatori in cieco ed hanno effettuato esame di gait analysis (3D-GA) utilizzando un sistema optoelettronico. Tutti pazienti hanno eseguito le valutazioni in fase OFF (dopo sospensione di 12 ore della terapia farmacologia) ed in fase ON  dopo somministrazione di una dose sovramassimale di farmaco (250 mg di levodopa pronta). In tutti i pazienti le percentuali di miglioramento motorio, valutate con scala clinica UPDRS parte III, erano sovrapponibili alle percentuali di miglioramento ottenute con valutazione 3D GA. Ci si auspica, pertanto, un ruolo crescente dell’innovazione tecnologica e dell’uso di sistemi avanzati per la valutazione quantitativa degli interventi terapeutici sia di natura farmacologia, chirurgica che riabilitativa. Essi costituiscono un valido arricchimento ed integrazione dei tradizionali metodi di valutazione clinica fornendo informazioni ed indici di grande utilità nella scelta e nel controllo dei percorsi terapeutici. 
  Nella MdP, risulta deficitaria la capacità decisionale nella pianificazione ed esecuzione di un’azione. È quindi necessario fornire una sorgente esterna finalizzata alla re-sincronizzazione del movimento. Stimoli uditivi facilitano il controllo di pattern di movimento attraverso l’influenza del ritmo di sequenze motorie apprese, la riduzione della sensazione di affaticamento, la facilitazione della performance del movimento, la  riduzione del tempo di latenza e l’incremento della qualità nella risposta, fornendo un feedback uditivo. In letteratura sono riportati diversi studi di approccio musicoterapico, con diverse tipologie di stimoli. Tra le più utilizzate, la RAS (Rhythmic Auditory Stimulation) sfrutta le componenti ritmiche, melodiche, armoniche ed elementi dinamico-acustici per strutturare e stimolare il movimento. I ricercatori hanno voluto dimostrare l’efficacia dell’associazione di stimoli sonoro-musicali nella riabilitazione della Malattia di Parkinson selezionando stimoli adatti al miglioramento, all’organizzazione e alla pianificazione delle azioni finalizzate, ed utilizzando come strumento di valutazione la 3D-GA.
  Sono stati reclutati 15 pazienti affetti da Malattia di Parkinson diagnosticati secondo i criteri della UK Brain Bank. Tutti i pazienti hanno partecipato a 16 sedute di musicoterapia (2 a settimana). Gli stimoli musicali utilizzati rispondevano alle seguenti caratteristiche: coerenza interna tra ritmo e melodia, evitando strutture sonoro-musicali complesse; strutture musicali con enfasi ritmica, musiche emotivamente significative. Tutti i pazienti sono stati sottoposti a valutazione clinica con scale UPDRS parte III da 2 operatori in cieco e valutazione 3D-GA prima del training musicale utilizzando un sistema optoelettronico. Alla fine del ciclo di musicoterapia, il paziente viene sottoposto a rivalutazione 3D-GA durante setting musicale (per ogni paziente è stato scelto un brano diverso che rispettasse le caratteristiche di ritmo del passo e coerenza interna del paziente).
   Valutazione dell’efficacia dell’idrochinesiterapia nei disturbi dell’equilibrio.
  In questo studio sono stati studiati 10 pazienti affetti da patologia parkinsoniana atipica (PSP), patologia in cui il disturbo dell’equilibrio è particolarmente compromesso causando rovinose cadute. I pazienti sono stati sottoposti in ingresso ed in uscita ad una valutazione stabilometrica secondo le norme standard della Società Francese di Posturologia. Sono state inoltre somministrate le scale per la valutazione del carico assistenziale (FIM), del recupero funzionale (motricity index), della qualità della vita (SF-12) e dell’equilibrio (Dizziness Handicap).
  I pazienti sono stati sottoposti a terapia standard basata sul miglioramento dell’ equilibrio e della coordinazione neuromotoria in associazione o meno ad idrochinesiterapia. Tutti i parametri pre- e post-riabilitativi sono stati analizzati mediante analisi statistica per verificare la significatività statistica di un eventuale miglioramento clinico e della eventuale adozione di alcuni specifici parametri come indici di monitorizzazione della patologia e della validità del processo riabilitativo. I risultati riguardanti questo tipo di pazienti non hanno mostrato miglioramento significativo dei disturbi dell ’equilibrio. La validità della metodica riabilitativa induce ad approfondire con un numero maggiore di pazienti, allargando a pazienti meno compromessi, ad esempio con Malattia di Parkinson tipica.

13. Caratterizzazione del ruolo dei recettori metabotropici del glutammato nei processi di sopravvivenza e differenziamento delle cellule ES e NSC in vitro 

La terapia di trapianto cellulare è attualmente considerata come uno degli approcci sperimentali più promettenti per la terapia delle malattie neurodegenerative. Tra le possibili candidate al trapianto cellulare vi sono le cellule staminali embrionali e neurali. Le prime sono isolate dalla blastocisti pre-impianto e sono totipotenti, cioè in grado di differenziare in qualsiasi cellula somatica; le seconde sono isolate dal cervello embrionale o adulto e differenziano principalmente in astrociti, neuroni ed oligodendrociti. Le cellule staminali embrionali (cellule ES) sono più plastiche e facilmente maneggevoli, ma hanno il limite di poter indurre, una volta impiantate nell’ospite, l’insorgenza di pericolosi teratomi. Le cellule staminali neurali (NSC) sono più facilmente reperibili e sono prive di potenziale tumorigenico; tuttavia, una volta impiantate, sopravvivono con difficoltà e danno origine soprattutto ad astrociti. Dunque, l’uso di cellule staminali, nella terapia di trapianto cellulare, è limitato delle attuali scarse conoscenze sui segnali extracellulari che regolano la proliferazione e sopravvivenza, o guidano il differenziamento di queste cellule nei diversi fenotipi cellulari. In particolare, si conosce poco come recettori accoppiati a proteine G (recettori metabotropici) regolino la fisiologia delle staminali, sebbene questi recettori siano i target della maggior parte dei farmaci oggi disponibili sul mercato.
Scopo delle ricerca proposta è la caratterizzazione del ruolo dei recettori metabotropici del glutammato nei processi di sopravvivenza e differenziamento delle cellule ES e NSC in vitro.
Per valutare il ruolo dei recettori metabotropici del glutammato nel differeniamento neuronale delle cellule staminali embrionali, cellule staminali  embrionali di topo sono state indotte a differenziare secondo due diversi protocolli sperimentali: i) colture in monostrato coltivate in  un mezzo noto per facilitare il differenziamento neuronale,  DMEM/F12 supplementato N2/B27; o ii)corpi embrionali in sospensione esposti ad acido retinico 1 mM per 4 giorni, a partire dal 4° giorno in coltura e successivamente ripiastrati in terreno DMEM/F12. Combinando l’analisi western blot all’analisi RT-PCR è stata studiata l’espressione dei recettori metabotropici del glutammato (mGluR) nelle cellule staminali indifferenziate. Queste cellule sono risultate esprimere unicamente il recettore mGluR5. Quando le cellule staminali embrionali sono state indotte a differenziare in monostrato in presenza di DMEM/F12, continuano ad esprimere mGluR5 per tutto il periodo di differenziamento in vitro. Si è scelto di studiare il ruolo di mGluR5 nel differenziamento neurale delle colture di staminali embrionali fatte differenziare in monostrato. Il blocco selettivo dei recettori mGluR5 con l’antagonista non competitivo metil-6-(feniletinil)-piridina (MPEP) (1 microM, aggiunto ogni giorno alle colture)è risultato accelerare la comparsa del marker neuronale beta-tubulina. Inoltre, il trattamento con MPEP ha aumentato il numero di neuroni esprimenti l’enzima decarbossilasi dell’acido glutammico-65/67, GAD65/67, un marker di neuroni GABAergici. Nelle colture di corpi embrionali in sospensione, i recettori mGluR5 sono progressivamente rimpiazzati dai recettori mGluR4, dal primo al quarto giorno in coltura. E’ stato studiato il ruolo del recettore mGluR4 nel differenziamento neurale dei corpi embrionali. L’agonista ortosterico dei recettori mGluR4/6/7/8, L-2-amino-4-fosfonobutanoate (L-AP4), o il modulatore allosterico positivo, PHCCC, entrambi combinati con l’acido retinico alla concentrazione di 30 microMolare, sono risultati aumentare l’espressione della both beta-tubulin e di GAD(65/67), e indurre la comparsa di neuroni completamente differenziati in grado di rilasciare GABA in risposta a stimoli depolarizzanti. Questi dati permettono di concludere che: i) sottotipi specifici di mGluR sono in grado di modulare il differenziamento neuronale delle cellule staminali embrionali in modo contesto dipendente; ii) ligandi sottotipo selettivi di questi recettori potrebbero essere usati per ottimizzare protocolli in vitro aventi lo scopo di produrre neuroni GABAergici da colture di cellule staminali; e iii) ligandi dei reettori mGluR possono essere potenzialmente utilizzati in vivo per ottimizzare la terapia di sostituzione cellulare in malattie neurodegenerative del SNC caratterizzate da un deficit GABAergico, come ad esempio la corea di Huntington.

 14. Miglioramento delle cure nei pazienti con Morbo di Parkinson

I pazienti con malattia di Parkinson vanno incontro a perdita di peso non spiegabile con maggiore attività fisica o cambiamento delle abitudini alimentari. La concentrazione plasmatica di cisteina durante il digiuno (nella notte e nelle prime ore del mattino, stato post-assorbimento) diminuisce con l’età. Questa diminuzione è associata ad una carenza a livello dei tessuti di glutatione, il più importante antiossidante a basso peso molecolare. Inoltre, la carenza di cisteina sembra essere il risultato di una alterazione a livello del processo autofagico di degradazione delle proteine, che normalmente assicura un corretto apporto di amino acidi liberi durante il digiuno. Il processo autofagico è regolato negativamente dalla segnalazione a cascata mediata dal recettore dell’insulina. Inoltre, in assenza di insulina questa via è modulata da stress ossidativo. Questa sinossi di processi apparentemente non correlati rivela un nuovo meccanismo di induzione di stress ossidativo in cui la diminuzione di antiossidanti e l’attivazione della segnalazione basale (post-assorbimento) del recettore dell’insulina porta alla compromissione non solo del processo autofagico del catabolismo delle proteine ma anche all’alterazione dell’attività di alcuni fattori di trascrizione quali FOXO. Dalla letteratura emerge che queste due funzioni influenzano in modo significativo la durata della vita in diversi modelli animali di invecchiamento.
In questo progetto si intende studiare il ruolo della cisteina nel dimagrimento del paziente con malattia di Parkinson e il possibile ruolo di un cambiamento dietetico nel recupero.
Nel primo anno è stato reclutato un numero soddisfacente di plasma in pazienti affetti da Parkinson e relativi controlli. I campioni sono stati trattati secondo modalità messi appunto dal laboratorio per la determinazione dei tioli non proteici plasmatici. In particolare tramite la tecnica HPLC è stato determinato il contenuto di glutatione ridotto ed ossidato e della cisteina totale, ridotta e ossidata.
I risultati ottenuti sono di particolare interresse in quanto mettono in evidenza l’aumento di una delle specie ossidate a scapito delle forme ridotte del glutatione che della cisteina.
Nel secondo anno si prevede di aumentare il numero di pazienti e dei Parkinsoniani per confermare tali risultati.

15. Ottimizzazione della levodopa

Le complicanze motorie sono uno dei fattori maggiormente limitanti nella cura a lungo termine dei pazienti con Malattia di Parkinson. La stimolazione pulsatile dei recettori post sinaptici dovuta all’uso di farmaci a breve emivita come la levodopa sembra essere un fattore determinante. Infatti il sistema dopaminergico fisiologicamente funziona grazie ad un rilascio costante di dopamina che fa si che il sistema dei gangli della base mantenga il suo equilibrio e i movimenti siano eseguiti in modo corretto senza la comparsa di movimenti anomali. La stimolazione pulsatile porta ad uno sbilanciamento con la conseguente comparsa di fluttuazioni motorie e discinesie. Si è sempre ipotizzato che nelle fasi iniziali di malattia le cellule dopaminergiche residue riescano ad immagazzinare la levodopa somministrata per la terapia e a limitare quindi l’oscillazione dei livelli cerebrali di dopamina. In queste circostanze non ci sarebbero fluttuazioni motorie e le discinesie sarebbero una conseguenza della terapia nelle fasi avanzate di malattia. Se si accetta questa ipotesi, il modo di somministrazione iniziale della levodopa non rivestirebbe una particolare importanza. Un’altra teoria sostiene invece che le oscillazioni nei livelli plasmatici di levodopa produrrebbero precocemente livelli oscillanti di dopamina con conseguente stimolazione pulsatile postsinaptica e sbilanciamento dei gangli della base. La comparsa delle discinesie determinerebbe i momento in cui i sistemi di compenso intracerebrali verrebbero meno. Se questa teoria risultasse veritiera il modo di somministrare la levodopa inizialmente dovrebbe essere completamente rivisto ed assumerebbe un’importanza fondamentale per la corretta terapia della malattia. Tale progetto ha come obiettivo la comprensione della migliore modalità di somministrazione dei farmaci antiparkinsoniani per lo sviluppo delle complicazioni motorie.
Nel corso del 1° anno della ricerca, i ricercatori hanno iniziato a studiare la presenza di fluttuazioni motorie precliniche, ovvero fluttuazioni nelle capacità motorie non apprezzabili dal paziente ma comunque presenti, che dimostrerebbero che anche nelle fasi precoci di malattia i livelli oscillanti di levodopa producono una stimolazione pulsatile e quindi non fisiologica. Lo studio è stato condotto su 6 pazienti in fase precoce e quindi stabile di malattia che non avevano mai assunto la levodopa. Si prevede di valutare complessivamente 10 pazienti. Tutti i pazienti hanno eseguito la valutazione clinica (con le prove del bullone e del tapping ogni 20 minuti a partire dalle ore 08:00), e prelievo di campioni di sangue per la determinazione dei livelli plasmatici di levodopa ogni 30 minuti per 4 ore in basale, dopo l’assunzione della prima dose di L-dopa e dopo 2 settimane di assunzione. I livelli plasmatici della levodopa sono analizzati con metodica HPLC. L’analisi dei dati è ancora in fase preliminare ma dimostra l’effettiva presenza di fluttuazioni delle performance motorie già in fase precoce di malattia.
Sono stati valutati anche pazienti con gravità di malattia più avanzata e con chiare fluttuazioni motorie (almeno 2 ore di OFF giornaliere).
Sono stati studiati 15 pazienti (in programma 25 pazienti), assegnati a 3 coorti corrispondenti tre differenti tipologie di trattamento, cioè 2 differenti formulazioni di levodopa somministrati a 2 differenti intervalli di tempo. I pazienti assegnati alla coorte 3 ricevono una dose addizionale di entacapone con ogni dose di trattamento attivo. Le concentrazioni di levodopa plasmatica sono state determinate mediante prelievo ematico prima e dopo la somministrazione di farmaco durante ciascun giorno di studio. I prelievi sono eseguiti ogni 20 minuti per un periodo totale di 12 ore dalla prima somministrazione di farmaco (effettuati un totale di 29 prelievi nella coorte 1 e di 31 nella coorte 2 e 3). I livelli plasmatici della levodopa sono analizzati con metodica HPLC. Durante le due giornate di studio i pazienti hanno completato dei diari clinici in modo da correlare lo stato di on/off e presenza discinesie con i dati di farmacocinetica raccolti. L’analisi dei dati è ancora in fase preliminare e si prevede di continuare l’arruolamento dei pazienti nel 2° anno della ricerca.

 16. La terapia occupazionale nella cura del Morbo di Parkinson

La Terapia Occupazionale promuove la salute e il benessere attraverso l’occupazione. L’obiettivo principale della Terapia Occupazionale è quello di rendere le persone capaci di partecipare alle attività della vita quotidiana. I terapisti occupazionali raggiungono questo risultato sia rendendo le persone capaci di fare cose che incrementino la loro capacità di partecipare, sia modificando l’ ambiente per meglio sostenere la partecipazione (World Federation Of Occupational Therapists 2002).
Relativamente ai trattamenti per i pazienti con malattia di Parkinson e parkinsonismi, l'obiettivo è far raggiungere, o mantenere, la maggior autonomia e la miglior qualità di vita possibili nella quotidianità del paziente, cioè nella cura di sé, nel lavoro o studio e nel tempo libero. Questo viene ottenuto attraverso: il recupero delle abilità funzionali e capacità motorie e cognitive, il miglioramento e il mantenimento delle abilità residue, l'adattamento delle limitazioni funzionali presenti e lo sviluppo di strategie compensative, l'adattamento dell' ambiente di vita, per sostenere l’autonomia, la stimolazione della motivazione al miglioramento della qualità di vita, aiutarndo a cambiare lo stile di vita del paziente man mano che progredisce la malattia
In questo protocollo sono state previste sedute individuali trisettimanali di 60 minuti ciascuna per 3 mesi. Nei primi tre incontri si identificano le aree di difficoltà nelle performance occupazionali del cliente con analisi della performance per identificare le priorità del cliente nell’ambito delle performance occupazionali. Dal quarto incontro si impostano le attività terapeutiche di tipo motorio-funzionale, scelte tra quelle gradite al cliente, e selezionate per mantenere, e migliorare la mobilità, la motricità (grossolana e fine), l’equilibrio, la coordinazione, nell’ambito delle performance indicate come prioritarie dal cliente.
Nel primo anno dello studio sono stati inseriti nel programma 40 pazienti con Malattia di Parkinson e altri Parkinsonismi (MSA, PSP). I pazienti sono stati suddivisi in due gruppi omogenei per età, sesso e anni di malattia. Il gruppo di controllo è stato sottoposto a protocolli standard di terapia comportamentale e cognitiva mentre il gruppo di studio è stato sottoposto a terapia occupazionale specifica come descritto nei materiali e metodi. La durata del trattamento e la quantità delle sedute comprese nel trattamento riabilitativo sono stati uguali nei due gruppi. Ogni paziente è stato valutato tramite l’esecuzione di scale validate (UPDRS, Indice di Barthel e Spitzer) nel periodo pre  e post terapia occupazionale. L’analisi statistica dei risultati ottenuti (ancora in corso) è stata effettuata con test di Mann-Whitney and test di Wilcoxon. I primi dati mostrano comunque un miglioramento dell’indice di qualità della vita e una maggiore abilità nell’affrontare le difficoltà incontrate sia durante le attività della vita quotidiana che del tempo libero nel gruppo sottoposto a terapia occupazionale rispetto al gruppo di controllo.

17. Il dolore nel Parkinson: modello sperimentale e studio sull uomo

La malattia di Parkinson (MP), nella sua accezione e rivisitazione più moderna, è considerata una malattia degenerativa che si caratterizza per il coinvolgimento di più sistemi ed in cui l’interessamento delle vie dopaminergiche è solo un aspetto del problema. La MP non va infatti considerata soltanto per la compromissione dell autonomia motoria, ma anche per i cosiddetti sintomi non motori, che occupano un ruolo rilevante nella gestione della malattia e che sono diventati oggetto di studio soprattutto negli ultimi anni. Tra i sintomi non motori della MP, il dolore riveste un ruolo importante per frequenza e disabilità correlata, ma rappresenta un aspetto poco studiato ed a patogenesi ancora non chiarita. La prevalenza del sintomo dolore in tali pazienti varia dal 40% al 75% e nel 10-30% dei casi è di difficile interpretazione in quanto non può essere correlato a nessuna patologia evidente (“dolore primario parkinsoniano”). Studi di psicofisica hanno documentato una riduzione della soglia allo stimolo doloroso calorico, ma uno studio neurofisiologico delle vie nocicettive non è stato mai eseguito. Si tratta in genere di sintomi sensoriali riferiti come parestesie urenti, dolenzia profonda, torpore, disestesie algide in particolari regioni del corpo o una sensazione diffusa di tensione e spiacevolezza che possono precedere l’ esordio della classica sindrome parkinsoniana e che sono stati definiti con il termine di dolore primario parkinsoniano. La patogenesi di tale fenomeno, ancora in realtà sconosciuta, potrebbe essere correlata al deficit dopaminergico (la degenerazione delle fibre dopaminergiche discendenti inibitorie, che originano a livello del mesencefalo e della substantia nigra, provocherebbe la disinibizione dell attività nocicettiva spinale), ma anche all interessamento di altri sistemi (i.e. il sistema noradrenergico a partenza dal locus coeruleus). Lo scopo del progetto è quello di arrivare ad una conoscenza esaustiva dei meccanismi fisiopatologici alla base della sindrome dolorosa in pazienti affetti da MP, AMS e PSP, valutando la funzionalità del sistema nocicettivo in pazienti affetti da MP con sindrome dolorosa cronica tramite la metodica dei Potenziali Evocati Laser CO2 (PEL), che  consente di studiare in maniera selettiva le fibre della sensibilità dolorifica. Dal momento che in alcune sindromi dolorose croniche, come l’emicrania e la sindrome X cardiaca, è stato dimostrato un deficit di abitudine, fenomeno per il quale la risposta evocata da uno stimolo doloroso si riduce fisiologicamente di ampiezza in seguito alla ripetizione dello stimolo stesso, è stato utilizzato un protocollo che consentisse di valutare se anche nei pazienti affetti da “dolore primario parkinsoniano” si evidenziasse tale fenomeno.
Nel corso del primo anno di studio sono stati studiati 7 pazienti affetti da MP con dolore cronico (totale 10) e 7 pazienti affetti da MP senza dolore (totale 10). I PEL sono stati registrati tramite 4 elettrodi posti sullo scalpo dopo stimolazione della regione dolorosa e di una regione simmetrica non-dolorosa. Tre serie successive, ciascuna di 30 stimoli laser, sono state somministrate in entrambi i siti a circa 5 minuti l’una dall’altra. L’intensità del dolore spontaneo e di quello provocato dallo stimolo laser è stata misurata tramite una scala visiva analoga (VAS) (0-100 mm). I risultati preliminari mostrano che nei pazienti con MP senza dolore l’ampiezza dei PEL si riduceva in media di circa il 10% nella seconda registrazione e di circa il 45% nella terza registrazione, rispetto all’ampiezza misurata nella prima serie. Nei pazienti con MP e dolore cronico tale fenomeno di abitudine, seppur presente, si mostrava meno evidente, in quanto l’ampiezza dei PEL, rispetto a quella misurata durante la prima serie, si riduceva di circa il 15% durante la seconda serie e di massimo il 20% durante la terza registrazione. I risultati del nostro studio, seppur ancora in fase preliminare, sembrano suggerire la presenza di un deficit di abitudine allo stimolo nocicettivo e quindi una condizione di alterata eccitabilità della corteccia cerebrale nei pazienti affetti da MP che lamentano dolore cronico. L’eventuale conferma di tali dati al termine dello studio potrebbe avere risvolti importanti sia sulla comprensione dei meccanismi eziopatogenetici che sul corretto trattamento farmacologico del sintomo dolore. 

18. Verso una valutazione non invasiva della disfagia

La Videofluoroscopia (VFS) e la Valutazione endoscopica della deglutizione con fibra ottica flessibile (Fiberoptic Endoscopic Examination of Swallow, FEES), sono i due esami standard nella valutazione clinica della deglutizione ma, ambedue, sono potenzialmente lesive in quanto la prima comporta una esposizione prolungata alle radiazioni e la seconda si effettua inserendo, attraverso il naso, una fibra  ottica flessibile, per  giungere all’ipofaringe.
La Ecografia e la EMGrafia dei muscoli coinvolti nella deglutizione sono, invece, esami non lesivi né invasivi e quindi vi è un interesse crescente per lo sviluppo di queste metodiche finalizzate alla valutazione visiva ed alla quantificazione dei disturbi della deglutizione.
La caratteristica principale della ecografia  è quella di far visualizzare i tessuti molli senza il rischio di esposizione alle radiazioni e quindi può essere utilizzata ripetutamente e senza limiti di durata. La ecografia è una metodica affidabile nella valutazione della fase preparatoria orale ed in quella orofaringea della deglutizione.
L’attività muscolare associata ai movimenti deglutitori può essere registrata con tecnica EMGrafica intramuscolare o di superficie, la prima riservata fondamentalmente alla ricerca, la seconda ad uso clinico.
La EMGrafia di superficie (sEMG) è rapida e semplice e può essere effettuata facilmente. E’ possibile valutare il Limite di disfagia, il Tempo di reazione e l’Ampiezza e la Durata della attività muscolare. Ciascun Laboratorio deve provvedersi di una propria normativa ed i dati possono essere utilizzati a fine di screening, per localizzare il meccanismo patologico e nella valutazione pre e post riabilitativa del trattamento.
La ecografia del cavo orale e la EMGrafia dei muscoli submentali sono, nel loro insieme, una buona metodica di screening strumentale non invasivo dei disturbi della deglutizione, la prima essendo più mirata alla valutazione della fase orale iniziale, la seconda a quella della fase orale finale, della fase faringea e della fase esofagea iniziale.
La assenza di una standardizzazione comune delle tecniche di esame e la grande variabilità delle normative e dei limiti oltre i quali i valori vanno considerati patologici, non danno, al momento, a questi esami un valore clinico diagnostico; ogni Laboratorio deve quindi provvedersi di una normativa interna e di valori di sensibilità e di specificità avendo come test di riferimento la VFS e la FEES. Vi sono tuttavia grandi prospettive di studio e di applicabilità che saranno utili soprattutto in campo infantile.
Né la ecografia del cavo orale, né la EMGrafia dei muscoli submentali sono in grado, al momento, di valutare la presenza/assenza di aspirazione, quesito essenziale quando si affrontano i disturbi della deglutizione. Buone prospettive vengono, in questa direzione, dalla Sonografia deglutitoria che, grazie ai moderni sistemi di analisi, potrebbe permettere di diversificare il suono respiratorio/deglutitorio normale da quello con aspirazione

19. Analisi delle componenti principali per l’estrazione di caratteristiche di un nuvo esame della postura dinamica

Il mantenimento dell’equilibrio implica l’integrazione centrale di diversi ingressi sensoriali; il nucleo vestibolare riceve informazione dai sistemi somatosensoriale, visivo e vestibolare che sono coinvolti nel processo di selezione e combinazione delle appropriate informazioni sensoriali. Questo processo è definito “organizzazione sensoriale”. Il ruolo della funzione dell’equilibrio è quello di mantenere il centro di gravità del corpo all’interno della base di supporto sia durante compiti statici che dinamici.
Sono numerose le metodologie che si prefiggono di valutare l’efficienza del controllo posturale e l’integrità della funzione vestibolo-spinale. Le oscillazioni posturali dei pazienti possono essere analizzate tramite tecnologie basate sull’uso di piattaforme di forza che acquisiscono i valori delle forze applicate sulle loro superfici nel tempo. I movimenti del punto di applicazione della risultante delle forze verticali (Centro delle Pressioni, CoP), infatti, forniscono una misura indiretta delle oscillazioni posturali. La Stabilometria e la Posturografia Dinamica Computerizzata (CDP) sono due metodi quantitativi per la valutazione dell’equilibrio in posizione eretta.
La Stabilometria, non fornendo informazioni sui meccanismi motori e sensoriali coinvolti nel controllo posturale, non è un test specifico per l’identificazione di disturbi vestibolospinali che potrebbero determinare un deficit posturale.
Il Test di Organizzazione Sensoriale (SOT) della CDP analizza, invece, le performance di equilibrio di un soggetto durante sei diverse condizioni di prova. L’analisi del SOT può aiutare ad identificare le cause di instabilità e le strategie utilizzate dai pazienti nel mantenimento dell’equilibrio.
Il SOT è un test utilizzato per la diagnosi di deficit vestibolospinali e nella valutazione del processo di integrazione sensoriale a livello centrale. I punteggi di equilibrio, calcolati per ogni singola prova, e il Composite Score (CS) del SOT sono parametri adimensionali che descrivono la capacità di mantenere l’equilibrio del soggetto.  Quando il CS e l’integrazione sensoriale presentano valori nella norma, i clinici possono ottenere dal SOT solamente informazioni riguardanti l’ampiezza dello spostamento del CoP. Inoltre il SOT non analizza diversi parametri che caratterizzano la traiettoria del CoP, in particolare, nel valutare i risultati di questo esame, non sono prese in considerazione misure in frequenza e velocità e non sono descritte le direzioni principali di spostamento del CoP. Il SOT presenta un’alta sensibilità nella valutazione dei soggetti veri positivi e rappresenta uno strumento utile per la valutazione dell’outcome della riabilitazione vestibolare dell’equilibrio. L’ obbiettivo è quello di presentare una nuova analisi, basata sui dati acquisiti durante il SOT, che permetta di ridurre il numero di falsi negativi; lo stesso tentativo è stato proposto anche da altri studi in letteratura.
La Stabilometria studia gli spostamenti del CoP, da questa analisi è possibile calcolare un set di diversi parametri tra i quali Rocchi et al. hanno identificato, tramite Analisi delle Componenti Principali (PCA), quelli più sensibili nella valutazione della performance posturale durante una singola condizione di acquisizione statica. In questo studio si estendono tali risultati alle sei condizioni del SOT. I parametri così selezionati potranno essere utili sia a fini clinici che di ricerca, aumentando la sensibilità del SOT nella discriminazione di diverse patologie che coinvolgono l’equilibrio, anche in quei soggetti che presentano punteggi SOT nella norma (falsi negativi) e in quelli che sono affetti da disfunzioni sub-cliniche dell’equilibrio.
A tal fine abbiamo studiato 37 soggetti sani (15 uomini e 22 donne) che non presentavano segni evidenti di patologie muscolo-scheletriche o neurologiche. L’età media dei soggetti era di 43,19 anni (deviazione standard 13,27 anni, range 21-68 anni).
Il set-up sperimentale consisteva nelle sei condizioni del SOT, durante le quali le condizioni somatosensoriali e visive sono sistematicamente alterate e le risposte posturali del soggetto sono registrate e misurate.
Nella Condizione 6, otto parametri stabilometrici su quattordici sono risultati essere correlati con l’età dei soggetti: MD (r2=0,38), RMS (r2=0,38), RANGE (r2=0,36), MV (r2=0,42), TP (r2=0,25), CCA (r2=0,34), CEA (r2=0,34), SA (r2=0,37). In tutte le altre condizioni di prova non sono state rilevate correlazione tra i parametri stabilometrici e i regressori scelti.
Lo studio di 37 soggetti sani che presentano normali valori nel CS e normale pattern nell’analisi del SOT, ha mostrato una ben più ampia gamma di  risposte quando abbiamo valutato altri parametri stabilometrici. I dati hanno mostrato quanto siano in effetti variabili le risposte dei soggetti sani, anche quando questi soggetti presentano punteggi simili nelle singole condizioni. L’analisi “classica” del SOT descrive solo il 50% della varianza totale dei parametri analizzati, essendo correlata solo con la prima Componente Principale (PC1) che in ogni condizione descrive circa il 50% delle caratteristiche della traiettoria del CoP.
Sulla base dei risultati ottenuti tramite la PCA è possibile creare quattro nuove variabili per l’analisi del SOT create come combinazioni lineari del gruppo di parametri stabilometrici di partenza.
Si è riscontrato che i singoli punteggi del SOT, che sono indicatori dell’ampiezza dell’oscillazione, non sono sufficienti a descrivere appieno lo spostamento del CoP e quindi le oscillazioni del soggetto in esame. Non sono stati ancora sviluppati test di analisi del controllo dell’equilibrio che permettano di distinguere tra gli effetti di diverse patologie nelle aree del SNC o tra anomalie del SNC e disturbi biomeccanici/muscolo-scheletrici. Ad esempio abbiamo notato che dei soggetti con patologie a carico del SNC, per esempio soggetti affetti da Morbo di Parkinson, che influenzano l’equilibrio posturale, spesso presentano risposte del SOT nella norma.
Lo studio conferma l’utilità del SOT per la valutazione dell’equilibrio, suggerendo un processo di estrazione delle caratteristiche, basato sulla PCA, per la scelta dei parametri di posturografia dinamica che permettano di migliorare il potere diagnostico del SOT. Sono tuttavia necessari ulteriori studi per valutare l’utilità di questo tipo di analisi nello studio delle strategie posturali utilizzate da popolazioni patologiche.

 20. Farmacocinetica, farmacodinamica e metabolismo di principi biologici attivi e di nuove formulazioni farmacologiche per il trattamento di malattie neurodegenerative e disordini cardiovascolari

Fluttuazioni della concentrazione plasmatica di alcuni farmaci costituiscono una dei maggiori ostacoli al conseguimento del successo terapeutico in determinati gruppi di pazienti. Al fine di minimizzare gli effetti collaterali e incrementare l’efficacia della terapia farmacologia, i farmaci possono essere somministrati in associazione con inibitori degli enzimi responsabili del loro catabolismo.  Utilizzando come modello il morbo di Parkinson, ad esempio, la somministrazione di L-dopa in associazione ad inibitori della catecol-O-metiltrasferasi (COMT) è in grado di stabilizzare i livelli plasmatici della levodopa, prolungandone l’emivita, senza causare una più elevata incidenza di discinesie di picco-dose.  Tuttavia una corretta valutazione della terapia farmacologica dipende strettamente dalla disponibilità di variabili analitiche e descrittive che facilitino l’analisi dell’efficacia del trattamento farmacologico e fungano da supporto decisionale per l’operatore medico per adeguare la terapia alle risposte specifiche del paziente.  Le variabili ad oggi in uso (i.e. regressione della curva trapezoidale, test di student, biodistribuzione, Cmax, t1/2) non prendono in considerazione le fluttuazioni della concentrazione plasmatica del principio attivo che riveste un ruolo cruciale per l’efficacia della terapia farmacologica.
L’obiettivo principale dello studio è stato, pertanto, quello di sviluppare una nuova metrica descrittiva denominata Drug Wave Test (DWT) che permette di misurare le fluttuazioni della concentrazione di un principio attivo nel tempo. Tale metrica è stata utilizzata per valutare la biodisponibilità del L-Dopa in pazienti affetti da morbo di Parkinson sottoposti a trattamento con levodopa in associazione con inibitori degli enzimi responsabili del suo catabolismo (catecol-O-metiltrasfersi). Gli studi sono stati eseguiti su coorti di pazienti con morbo di Parkinson utilizzando attrezzature avanzate per l’identificazione e la quantificazione di metaboliti presenti a basse concentrazioni nei liquidi biologici.  In particolare, la quantificazione di metaboliti è stata condotta su campioni biologici ottenuti dai pazienti in studio (plasma, siero ed urine) tramite cromatografia ad alta prestazione in modalità isocratica (HPLC) con detector elettrochimico (ECD) in oxidation mode, tecnologia che permette una quantificazione riproducibile (CV< 5%) di fino a 10 metaboliti contemporaneamente.  I dati ottenuti sono stati analizzati sia tramite le tradizionali tecniche statistiche (regressione della curva trapezoidale, test di Student, Biodistribuzione, Cmax, t1/2), sia tramite la nuova variabile appositamente sviluppata, DWT.  Inoltre, tecniche avanzate di Principal component Analisys e Non-Supervised Data Analysis sono state impiegate per correlare i dati di farmacocinetica con l’output clinico ed il profilo genetico dei pazienti, in particolare con i polimorfismi dei geni codificanti per le COMT.
Dal punto di vista scientifico il risultato di maggior interesse è stata la validazione di una metodologia innovativa per la determinazione di parametri di farmacocinetica che prenda in considerazione le fluttuazioni della concentrazione plasmatica del principio attivo (cruciale per l’efficacia della terapia farmacologica). Tale variabile è stata validata confrontandola con le metriche descrittive presenti in letteratura e la sua applicabilità come strumento di supporto decisionale per l’operatore medico è stata valuta nel contesto clinico.  La disponibilità di una metodologia che tiene in considerazione le fluttuazioni della concentrazione plasmatica del principio attivo apre la strada a numerosi studi di farmacocinetica, potendo essere applicata anche in modelli diversi dal morbo di Parkinson.  Sono inoltre in fase di rielaborazione i risultati ottenuti nello studio delle varianti di sequenza di alcuni geni coinvolti nella risposta al trattamento. Grazie anche alla possibilità di ampliamento della tipologia e numero dei pazienti reclutati, si prevede di delineare un pattern di alterazioni geniche associato alla risposta al trattamento.

21. L’ infiammazione sub-clinica quale fattore emergente nella valutazione del rischio cardiovascolare globale. Studio di marcatori molecolari di diagnosi, progressione, prognosi e risposta alla terapia

La comprensione dei meccanismi responsabili della progressione della malattia aterosclerotica verso le manifestazioni acute macrovascolari è notevolmente migliorata negli ultimi anni grazie ad una serie di studi che hanno permesso di definire l'importanza dei processi infiammatori implicati nell’insorgenza e progressione della malattia aterosclerotica. E' quindi evidente come l'identificazione di fattori di rischio “emergenti” possa costituire un importante obiettivo della comunità scientifica in ambito di prevenzione del rischio cardiovascolare non solo nella fase di prevenzione primaria, ma anche, e soprattutto durante il percorso riabilitativo del paziente con malattia aterotrombotica.  Obiettivo principale della linea di ricerca in oggetto è l’identificazione di marcatori biomolecolari dell’infiammazione cronica di basso grado associata alle patologie cardiovascolari  attraverso l’individuazione di varianti di sequenza o la caratterizzazione di profili proteici relativi a molecole coinvolte nei meccanismi di infiammazione e trasduzione del segnale, al fine ultimo di caratterizzare una serie di profili molecolari in associazione a biomarcatori classici da utilizzare quale strumento diagnostico utile alla determinazione del rischio cardiovascolare globale.
In considerazione della stretta interazione esistente tra alterazioni infiammatorie e modificazioni dell’assetto emostatico-coagulativo, sono stati analizzati alcuni marcatori di attivazione piastrinica o coagulativa in alcune coorti di pazienti con fattori di rischio maggiori o patologia cardiovascolare conclamata.  I risultati ottenuti in questi studi sono di notevole interesse per quanto riguarda la definizione del rischio e la gestione di pazienti con fattori di rischio cardiovascolare e/o malattia clinicamente evidente.  In particolare, sono state analizzate le possibili associazioni tra la presenza di attivazione piastrinica in vivo ed una condizione pro-infiammatoria/pro-angiogenetica attraverso la determinazione dei livelli plasmatici della forma solubile della P-selettina (sP-selettina, un marker di attivazione piastrinica in vivo), del ligando per il CD40 (sCD40L, una citochina pro-infiammatoria) e del VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor, il principale fattore proangiogenetico attivo nell’uomo). La stretta interrelazione tra tali molecole potrebbe rappresentare la chiave di legame tra stato pro-trombotico, stato pro-infiammatorio e angiogenesi in varie condizioni di rischio cardiovascolare.  sP-selettina, sCD40L e VEGF sono stati analizzati in individui con fattori di rischio, sfruttando essenzialmente il modello dell’ipertensione essenziale.  Tale scelta è stata dettata dal fatto che studi epidemiologici riguardanti i meccanismi causali delle malattie cardiovascolari hanno messo in risalto un modello di sviluppo del danno vascolare comune all’ipertensione ed altri fattori di rischio.   In sintesi, i risultati ottenuti hanno dimostrato in pazienti ipertesi l’esistenza di una condizione di stress ossidativo (soprattutto in pazienti con compromissione della funzionalità renale e microalbuminuria), responsabile, almeno in parte, di fenomeni di attivazione piastrinica in vivo, con conseguente rilascio di sCD40L da parte delle piastrine stesse, come confermato dagli effetti della terapia con aspirina a basse dosi.  La presenza di attivazione piastrinica in vivo era inoltre responsabile del rilascio da parte delle piastrine di VEGF in pazienti con ipertensione anche in assenza di danno d’organo, come dimostrato in uno studio caso-controllo effettuato su 80 pazienti con ipertensione essenziale sotto stretto controllo farmacologico e 40 soggetti normotesi appaiati per sesso ed età.  I risultati ottenuti dimostrano che pazienti ipertesi hanno livelli plasmatici di VEGF più elevati rispetto alla popolazione normotesa ed in stretta associazione con una condizione di attivazione piastrinica in vivo.  Il trattamento con aspirina, sia ex vivo sia in vivo, causava una riduzione significativa dei livelli di VEGF in correlazione diretta con l’inibizione farmacologica delle piastrine.
L’uso della terapia antiaggregante è ormai consuetudine nella prevenzione secondaria dell’ipertensione, anche se la sua efficacia in prevenzione primaria è ancora dibattuta.  Inoltre, nel corso di questi ultimi anni è stato dimostrato che gli effetti antiaggreganti di una dose fissa giornaliera di aspirina non sono costanti nel tempo e in tutti gli individui, ed è stata suggerita la possibilità dello sviluppo di una resistenza farmacologica.  Il monitoraggio laboratoristico dell'efficacia antiaggregante dell'aspirina è tuttora oggetto di discussione e, date le numerose variabili pre-analitiche ed analitiche in grado di influenzare i risultati, non vi sono vedute univoche sull’affidabilità dei vari test proposti per la determinazione di una condizione di attivazione piastrinica in vivo. Risultati recentemente ottenuti dal laboratorio su una coorte di pazienti con fattori di rischio noti per la patologia aterotrombotica (diabete, ipertensione, ipercolesterolemia e fumo) sembrano suggerire che la determinazione della sP-selettina possa rappresentare uno strumento utile per definire una condizione di attivazione piastrinica in vivo, anche, e soprattutto, in soggetti con fattori di rischio cardiovascolare, ma senza patologia aterosclerotica conclamata.  La possibilità di ridurre i livelli circolanti di tale marcatore con aspirina a basse dosi ne suggerisce, inoltre, l’uso potenziale nel monitoraggio di individui a rischio, non solo nella fase di prevenzione primaria, ma anche, e soprattutto durante il percorso riabilitativo del paziente con malattia aterotrombotica.

22. Identificazione di marcatori molecolari e profili genetici associati alla efficacia della terapia farmacologica in pazienti con patologie neurodegenerative e cardiovascolari sottoposti a riabilitazione motoria e sensoriale

Tra i recenti sviluppi nell'area della genetica molecolare, particolare interesse rivestono oggi le mutazioni geniche polimorfiche a singolo nucleotide o SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), principali responsabili della variabilità genetica umana, grazie alla quale ogni individuo è diverso da un altro. Nel genoma umano sono presenti più di un milione di SNPs su un totale di circa 3.2 miliardi di basi e la loro individuazione è alla base di tutta la post-genomica, scienza che studia le conseguenze dei dati ottenuti grazie al progetto genoma. Patterns di varianti di sequenza di una singola base, che possono causare la sintesi di proteine funzionalmente diverse nel caso in cui intercorrano su regioni codificanti, promoters o loci di stabilizzazione trascrizionale, possono determinare la predisposizione genetica ad una determinata patologia o essere responsabili della variabilità di risposta individuale al trattamento farmacologico. Dai risultati emersi da studi di linkage e di associazione genetica la valutazione di polimorfismi di singoli nucleotidi appare oggi infatti uno degli approcci più promettenti per individuare geni candidati o predisponenti a patologie multifattoriali. Inoltre, la valutazione dell’associazione positiva tra una variante di un gene e parametri clinici potrebbe contribuire alla definizione clinica ed al ruolo terapeutico di un determinato farmaco.
Obiettivo generale del programma è quello di caratterizzare una serie di profili genici in associazione a biomarcatori classici da utilizzare quale strumento predittivo di insorgenza di determinate patologie e/o di risposta alla terapia per la patologia di interesse.  Obiettivo specifico sul quale si è concentrato il nostro interesse nel corso del 2008 è stato lo studio delle varianti geniche associate ad alcune patologie degenerative rare al fine di individuare eventuali profili genici diagnostici/prognostici o utili all'impostazione della terapia.  In particolare, sono state studiate tre famiglie affette da una rara genodermatosi ereditaria (sindrome di Birt-Hogg-Dubé, BHD) che predispone i pazienti a sviluppare amartomi dei follicoli piliferi, pneumotorace, o carcinoma renale. La sindrome è causata da alcune mutazioni del gene della follicolina (FLCN), le più frequenti delle quali si verificano all'interno di un tratto C8 nell’esone 11, probabilmente a causa di uno "slittamento" della DNA polimerasi durante la replicazione del DNA, così come accade per altri geni che causano predisposizione al cancro.  L'analisi molecolare del gene FLCN ha mostrato la presenza di due mutazioni “frameshift”, non precedentemente descritte: (i) la delezione 1345delAAAG nell’esone 9, che introduce uno stop prematuro 24 aminoacidi a valle del codone 321 e (ii) l’inserzione 802insA nell’esone 5, che introduce uno stop prematuro 16 aminoacidi a valle del codone 132 e di una mutazione missense nell’esone 12 (G1788A).  Di particolare interesse è il fatto che le mutazioni negli esoni 9 e 12 si associavano a carcinomi gastrointestinali, mammari e della parotide, mentre quella nell’esone 5 era associata solo con le lesioni dermatologiche, suggerendo la presenza di una correlazione tra genotipo e fenotipo patologico e l’esistenza di diversi meccanismi patogenetici coinvolti nella predisposizione al cancro (specialmente della mammella) in famiglie con BHD.
Sempre nell’ambito delle patologie rare, è stata eseguita un’analisi mutazionale dei geni c-Kit (CD117) e PDGFR-alpha (Platelet-Derived Growth Factor Receptor, Alpha) in pazienti affetti da tumori gastro-intestinali stromali (GIST).  Mutazioni somatiche di tali geni correlano con la risposta all’Imatinib, farmaco specifico di recente introduzione per il trattamento di pazienti con GIST.  Una simile metodologia è stata applicata per lo studio dell’efficacia terapeutica di un altro farmaco antitumorale, il cetuximab, attivo in alcune forme di neoplasie gastrointestinale con un pathway K-ras indenne.  I dati preliminari ottenuti hanno permesso di identificare varianti di sequenza precedentemente non riscontrate per alcuni di questi geni.
Infine, sono stati analizzati campioni biologici ottenuti da donne affette da carcinoma della mammella al fine di valutare la possibile associazione tra il polimorfismo PAI-1 4G/5G, indagato sia sulla linea germinale sia sul DNA tumorale, i livelli plasmatici della proteina PAI-1 e le caratteristiche fenotipiche e cliniche della neoplasia mammaria. Il polimorfismo PAI-1 4G/5G è stato analizzato mediante analisi di sequenza diretta anche sulla linea germinale di 50 donne in apparente stato di buona salute e con una età media riferibile alla popolazione in studio.  La frequenza del polimorfismo 4G/5G sulla linea germinale nelle pazienti era distribuita in equilibrio di Hardy-Weinberg con le frequenze osservate nella popolazione di controllo. Non è stata riscontrata alcuna associazione tra la frequenza degli alleli 4G e 5G e le caratteristiche cliniche delle pazienti.  Per quanto riguarda le analisi condotte in parallelo sulla linea somatica, sono state riscontrate differenze nella lunghezza della sequenza mononucleotidica rispetto alla linea germinale in 5 pazienti.  Tale osservazione potrebbe essere correlata a fenomeni di instabilità genomica coinvolti nella progressione neoplastica del carcinoma mammario.  Allo scopo di validare tale ipotesi l’analisi del PAI-1 4G/5G è stata eseguita su un gruppo ristretto di pazienti con carcinoma della mammella e con caratteristiche biologiche riferibili ad una instabilità genomica valutata mediante MSI (instabilità dei microsatellite). I risultati preliminari ottenuti sembrerebbero indicare che la sequenza mononucleotidica ripetitiva del gene PAI-1 rappresenti un target di instabilità genomica, analogamente a quanto da noi osservato nel cancro ereditario del colonretto.

 23. Fisiologia e fisiopatologia dell'attività sinaptica nell'uomo.  Studio della plasticità cerebrale alla base di efficienti processi cognitivo-motori

Le reti neurali dei sistemi cerebrali cognitivo-motori sono soggette a continue modificazioni (plasticità) in termini di trasmissione sinaptica a seguito dell’esperienza, al fine di garantire una sempre più efficace azione finalizzata nell’uomo. L’unità di ricerca Neurolaboratorio della Scuola di Specializzazione in Medicina dello Sport ha lavorato nel 2007 per migliorare la comprensione dei processi cerebrali che concorrono a determinare prestazioni ottimali negli sport di combattimento e di destrezza, in vista di utilizzare queste conoscenze per ispirare innovative procedure di riabilitazione cognitivo-motoria nell’Uomo patologico. Tale finalità è stata perseguita mediante ricerche che hanno chiarito l’importante ruolo dei ritmi elettroencefalografici alpha (intorno a 10 Hz) nei processi di plasticità cerebrale alla base delle trasformazioni visuo-motorie e del mantenimento dell’equilibrio in atleti di élite di scherma, karate e golf. I risultati prodotti da queste ricerche, che sono stati pubblicati su riviste internazionali di Neuroscienze con fattore impatto, hanno richiesto una integrazione volta a creare le basi di conoscenza per migliorare le procedure di riabilitazione dell’equilibrio, delle trasformazioni visuo-motorie e del coordinamento bimanuale in atleti di élite e in pazienti con deficit dei sistemi motori. Con questo scopo generale, sono stati proposti per il 2008 i seguenti temi di ricerca:
Plasticità corticale a lungo termine. Comprensione dei processi fisiologici di plasticità corticale a lungo termine negli atleti di élite di Sport di Combattimento, relativi al controllo dell’equilibrio in base ai segnali propriocettivi ed esterocettivi.
Plasticità corticale a breve termine. Comprensione dei processi fisiologici di plasticità corticale a breve termine negli atleti di élite di Sport di destrezza, relativi all’apprendimento percettivo visuo-motorio.
Plasticità corticale delle differenze interemisferiche: Comprensione dei processi fisiologici di plasticità corticale delle differenze interemisferiche negli atleti di élite di Sport di Combattimento, relativi alla comprensione dell’azione sportiva da parte di altri atleti.
Plasticità corticale a lungo termineLa ricerca è stata svolta su 47 soggetti sperimentali (19 karateka di élite, 18 schermitori di élite e 10 non atleti). Tecniche elettroencefalografiche e biomeccaniche hanno permesso lo studio di fenomeni di plasticità corticale a lungo termine negli atleti di élite collegati all’uso di input visivi per il mantenimento dell’equilibrio e la locomozione. È stata valutata la correlazione tra i ritmi cerebrali dominanti dell’Uomo (intorno a 10 Hz), le oscillazioni stabilometriche e i meccanismi di accoppiamento funzionale cortico-muscolare associati all’equilibrio e alla locomozione.
Plasticità corticale a breve termine La ricerca è stata svolta su 15 atlete della nazionale di ginnastica ritmica chiamate a dare giudizi su video che illustrano performance di ginnastica ritmica. L’esattezza del loro giudizio sarà calcolata usando come riferimento il giudizio dell’allenatrice della nazionale italiana di ginnastica ritmica (Marina Piazza). Sono stati studiati mediante il sistema di EEG ad alta risoluzione spaziale i fenomeni di plasticità corticale a breve termine negli atleti di élite collegati alla comprensione dell’azione sportiva. È stata valutata in particolare la correlazione tra i ritmi cerebrali dominanti dell’Uomo (intorno a 10 Hz) e la fluttuazione della capacità delle atlete di giudicare correttamente la prestazione sportiva.
Plasticità corticale delle differenze interemisferiche .La ricerca è stata svolta su 40 soggetti sperimentali (15 karateka di élite, 10 schermitori di élite e 15 non atleti). Sono stati studiati mediante un sistema di EEG ad alta risoluzione spaziale i fenomeni di plasticità corticale delle differenze inter-emisferiche delle aree motorie collegati all’apprendimento percettivo visuo-motorio. È stata valutata in particolare la rappresentazione inter-emisferica dei ritmi cerebrali dominanti dell’Uomo (intorno a 10 Hz) e dei potenziali correlati al movimento.
Plasticità corticale a lungo termine. I risultati hanno mostrato un’ottimale modulazione dei ritmi alpha in risposta agli input visivi e un ottimale accoppiamento funzionale neuromotorio per il mantenimento della postura e la locomozione sia con che senza input visivi. Questi parametri fisiologici potrebbero essere utilizzati come riferimento per valutare gli effetti dell’allenamento sull’equilibrio in atleti di élite e in pazienti con deficit posturali nel corso della riabilitazione.
Plasticità corticale a breve termine.I risultati hanno mostrato che i giudizi corretti sono correlati ad una peculiare modulazione dei ritmi alpha nel senso della “efficacia neurale”: una selettiva riduzione del ritmo alpha su aree frontali e parietali compatibili con i sistemi “specchio”. Questo parametro fisiologico potrebbe essere utilizzato come riferimento per valutare gli effetti a breve termine dell’allenamento in atleti di élite e in pazienti con deficit visuo-motori nel corso della riabilitazione.
Plasticità corticale delle differenze interemisferiche I risultati hanno mostrato una modulazione bilaterale dei ritmi alpha e dei potenziali correlati al movimento sulle aree motorie primarie durante l’esecuzione del movimento unilaterale negli atleti di karate, rispetto agli atleti amatoriali e agli schermitori, questi risultati confermano l’ipotesi di una rappresentazione bi-emisferica del movimento nei karateka i cui schemi di attacco e difesa sono perfettamente bilaterali, rispetto agli schermitori che usano esclusivamente l’arto dominante (per cui ci si aspetta una rappresentazione emisferica contralaterale). Questo parametro fisiologico potrebbe essere utilizzato come riferimento per valutare gli effetti dell’allenamento in atleti di élite e in pazienti con deficit visuo-motori nel corso della riabilitazione.

 24. Caratterizzazione funzionale e approcci terapeutici a patologie umane causate da mutazioni in recettori nicotinici

Il presente progetto ha come obiettivo la caratterizzazione funzionale di recettori nicotinici dell'acetilcolina (nAChR), mutanti identificati in patologie umane, con particolare riguardo ai mecccanismi che potrebbero limitare l'accumulo di Ca2+ nella regione postsinaptica, causa principale del danno tissutale in caso di mutazioni gain-of-function.
In particolare vengono sudiate le caratteristiche funzionali, inclusa la permeabilita' al Ca2+, di nAChR identificati in alcuni pazienti con miastenia congenita da canale lento ed in pazienti con Sclerosi Laterale Amiotrofica.
Gli nAChR normali e mutanti sono espressi per trasfezione in cellule della linea GH4C1. Gli esperimenti sono eseguiti con la tecnica del patch-clamp nelle sue varianti.
Per quanto riguarda le mutazioni associate a miastenia congenita, è stato studiato il decadimento della risposta durante stimolazione protratta o ripetuta ad alta frequenza. Inoltre, è stata misurata la corrente frazionale (Pf), ossia la frazione della corrente totale (QTot) evocata dalla stimolazione nicotinica, che viene trasportata dallo ione Ca2+ (Pf = QCa/QTot), un parametro che fornisce una stima della permeabilita' al Ca2+ indipendente da assunzioni teoriche. Questo tipo di esperimenti prevede la misurazione contemporanea delle correnti nicotina-ativate (con la tecnica del patch-clamp) e delle variazioni della concentrazione intracellulare di Ca2+ ([Ca2+]i), tramite videomicroscopia. I risultati ottenuti sulle tre mutazioni considerate indicano che tutte danno origine ad una cinetica tipica del "canale lento", e inducono una riduzione della corrente evocata dall'acetilcolina durante stimolazione ripetuta maggiore rispetto a quella riscontrata in cellule di controllo. La permeabilita' al Ca2+ rimane immodificata.
Le mutazioni nei recettori nicotinici neuronali identificate in pazienti con SLA sono state caratterizzate a livello di singolo canale, indicando che esse possono alterare la funzionalita' dei recettori nicotinici. Altre modificazioni, indicative di una complessiva condizione di gain-of-function, sono state evidenziate con registrazioni delle correnti totali.

25. Studio funzionale di recettori di membrana da pazienti di Alzheimer

L’Alzheimer (AD) è una demenza senile progressiva caratterizzata, tra le altre cose, da una pronunciata neurodegenerazione dell’ippocampo e della corteccia entorinale. La fisiopatologia dell’AD e i problemi cognitivi conseguenti sembrano essere dovuti ad almeno due fattori: la deposizione di placche beta-amiloidee e la riduzione di funzionalità sinaptica. E’ opinione comune che sia i recettori inibitori GABAA che quelli eccitatori dell’AMPA e kainato (non-NMDA) possano avere una fisiopatologia alterata nei pazienti AD (Selkoe et al., 2002; Miledi et al., 2004; Armstrong et al., 2003; Mizukami et al., 1998).  Lo studio si prefigge di:
1) caratterizzare le risposte elettriche dei recettori del glutammato e del GABA (GABAA) in ovociti di Xenopus microtrapianti con membrane neuronali di corteccia ed ippocampo di pazienti post-mortem di AD (60-70 anni di età) e 
2) caratterizzare le risposte sia GABAergiche che glutamatergiche in ovociti di Xenopus microtrapiantati con tessuti post-mortem di pazienti pediatrici (tra 2 e 12 anni di età).
Si sono ottenuti preparati di membrane cellulari da pazienti AD,che  iniettate negli ovociti hanno generato correnti del GABA e del glutammato. Nei tessuti umani da pazienti AD c’è una forte morte cellulare, quindi le correnti del GABA ottenute sono di ampiezza estremamente piccola e difficilmente caratterizzabili.  Riguardo i pazienti pediatrici, sono stati  registrati correnti del GABA sia dalla corteccia che dall’ippocampo di pazienti operati per displasia corticale. In questi esperimenti è stato trovato un potenziale di inversione della corrente GABA estremamente depolarizzato. Questa parte del progetto continuerà nel 2009 con lo scopo di  dimostrare se l’alterazione della inibizione GABAergica nelle displasie corticali infantili sia dovuta ad una modifica dell’omeostasi del cloro. 

26. Ruolo della DNA-dependent protein kinase nella degenerazione neuronale e nella plasticità sinaptica

La DNA-PK è una serina/treonina chinasi essenziale per il riparo delle rotture a doppio filamento del DNA (DSBs). Diversi studi evidenziano una significativa diminuzione dei livelli proteici della DNA-PK, che si correla con una ridotta attività di riparo del DNA nella corteccia di pazienti affetti dalla malattia di Alzheimer (AD).
Tali studi delineano la DNA-PK come un potenziale biomarcatore per la diagnosi e per il monitoraggio della progressione dell’AD. A tal fine è stato condotto uno studio pilota utilizzando cellule PBMC derivanti da 10 buffy coat provenienti dal Centro Trasfusionale dell’Università “La Sapienza” di Roma. Su tali campioni sono stati analizzati i livelli di espressione del complesso della DNA-PK mediante tecniche di western blotting (wb). Le cellule PBMC sono state sottoposte ad un frazionamento subcellulare per separare il compartimento citoplasmatico da quello nucleare e successivamente i rispettivi lisati proteici sono stati analizzati in wb. Essendo nota la particolare suscettibilità alla degradazione da parte del complesso della DNA-PK in relazione al tempo che intercorre tra prelievo e purificazione cellulare, i livelli proteici del complesso sono stati analizzati su estratti proteici derivanti da PBMC isolati da sangue fresco e da sangue incubato a temperatura ambiente per 6 ore. Quest’analisi è stata necessaria per la standardizzazione delle procedure di prelievo, purificazione e conservazione sia in termini temporali che quantitativi. I risultati ottenuti mostrano che il complesso della DNA-PK non risulta degradato se si esegue la procedura di purificazione entro le 6 ore.
Lo studio ha inoltre evidenziato una significativa variabilità dei livelli della DNA-PK nell’ambito dei 10 campioni analizzati sia nella frazione nucleare che in quella citoplasmatica. Le stesse variazioni di livelli di espressione sono state osservate per le proteine Ku70 e Ku86. Questi esperimenti preliminari hanno evidenziato come sia necessaria l’analisi di un numero più ampio di campioni, come previsto dallo studio in esame, al fine di ottenere dati statisticamente significativi.
Inoltre, in seguito alla messa a punto di protocolli per la quantificazione relativa ed assoluta della DNA-PK mediante tecniche di spettrometria di massa, è stato possibile identificare la proteina direttamente nei lisati cellulari totali o frazionati di PBMC senza necessità di arricchire i campioni mediante tecniche di immunoprecipitazione. Questo risultato prospetta la possibilità di effettuare lo screening dei campioni provenienti dai pazienti AD in modo rapido, poco dispendioso e a partire da una quantità limitata di proteine.
Risultati attesi:
1. Identificazione della DNA-PK come marcatore periferico della malattia di Alzheimer
2. Approfondimento del ruolo delle proteine coinvolte nei meccanismi di riparo del DNA nella malattia di Alzheimer
3. Identificazione di un nuovo ruolo della DNA-PK nella plasticità neuronale
4. Identificazione di substrati specifici fosforilati dalla DNA-PK nelle membrane sinaptiche.

 27. Ruolo dell'alterazione della funzionalità nucleolare nella patogenesi della malattia di Alzheimer

Alcuni studi hanno evidenziato come nei pazienti affetti da Alzheimer (AD) sia presente un’alterazione del processo di sintesi proteica e più in generale una disfunzione della funzionalità nucleolare, struttura deputata alla biogenesi dei ribosomi. L’analisi di campioni cerebrali provenienti da pazienti Alzheimer ha rivelato come i livelli proteici di nucleolina, un’importante componente proteica strutturale e funzionale del nucleolo, sono fortemente diminuiti sia nell’ippocampo che nella corteccia, le regioni maggiormente colpite in questa patologia. Inoltre, è stato recentemente dimostrato come la maturazione e la biogenesi dei ribosomi sono alterati da un non corretto funzionamento del sistema dei proteasomi, un macchinario di degradazione proteica che è fortemente inibito in vitro in presenza di diversi conformeri del peptide amiloidogenico A1-42, il principale candidato nella patogenesi dell’AD, ed in vivo in modelli animali di malattia di Alzheimer. L’obiettivo generale del presente progetto è quindi determinare il ruolo della funzionalità nucleolare nell’alterazione della sintesi proteica associata alla malattia di Alzheimer. A tale scopo abbiamo usato il modello cellulare delle PC12 trattato con il peptide amiloidogenico A 25-35, il frammento minimo amiloidogenico del peptide A 1-42, un buon sistema per valutare gli effetti molecolari e cellulari del peptide A nella malattia di Alzheimer. I risultati che abbiamo finora ottenuto sono stati i seguenti:
1. Dosi elevate di A 25-35 sia monomerica che fibrillare inducono una forte riduzione dei livelli proteici di nucleolina.
2. L’effetto osservato mostra una dipendenza temporale che ha inizio dopo circa 8 ore di trattamento e culmina dopo 16-24 ore. Tale effetto è evidente sia in cellule proliferanti che in cellule post-mitotiche.
3. Il trattamento con agenti anti-ossidanti così come con inibitori specifici del sistema proteolitico dei proteasomi sembra ripristinare i livelli proteici originari della nucleolina.
Nel loro insieme questi risultati preliminari evidenziano come gli alti livelli di stress ossidativo, indotti dal peptide A 25-35, causano la degradazione della nucleolina, mediata in modo specifico dal sistema dei proteasomi e quindi indicano un potenziale coinvolgimento del peptide A nell’alterazione della funzione nucleolare.
Risultati attesi:
1. Identificazione del ruolo delle diverse conformazioni del peptide amiloidogenico A 25-35/1-42 nell’alterazione della struttura e della funzionalità del nucleolo.
2. Determinazione della correlazione tra generazione di A (sia intracellulare che extracellulare) ed alterazione della biogenesi e della funzionalità ribosomiale.
3. Determinazione della correlazione tra disfunzione del sistema dei proteasomi indotta da A 25-35/1-42 e alterazione della biogenesi e funzionalità dei ribosomi.
4. Identificazione della nucleolina come marcatore periferico della Malattia di Alzheimer.

 28. Malattia Niemann-Pick di tipo C: identificazione di biomarcatori periferici e sviluppo di nuovi approcci terapeutici basati sulla modulazione dei lipidi di membrana

Lo studio delle alterazioni funzionali delle membrane plasmatiche neuronali rappresenta un punto importante per la ricerca dei meccanismi patogenetici della Niemann-Pick di tipo C (NPC). In particolare, l’alterazione del traffico lipidico della membrana plasmatica, dovuta alla mutazione del gene NPC, potrebbe avere un ruolo chiave nella disfunzione neuronale e conseguentemente nella patologia clinica. In questo progetto sono state valutate le proprietà elettrofisiologiche nei neuroni NPC-/- rispetto ai neuroni di controllo. A tale scopo sono state usate fettine di ippocampo e colture ippocampali primarie derivanti da topi NPC-/-, un modello ben caratterizzato della malattia Niemann-Pick di tipo C e da topi di controllo. I risultati elettrofisiologici mostrano:
1. una ridotta risposta al trattamento con acido kainico nelle fettine di ippocampo derivanti dai topi NPC-/-
2. la riduzione del mantenimento del potenziamento a lungo termine (LTP) nella regione CA1 delle fettine di ippocampo dei topi NPC-/-, dove sono coinvolti i recettori NMDA
3. un ridotto influsso di calcio intracellulare indotto da aminoacidi eccitatori, rilevato su colture ippocampali di topi NPC-/-.
Nel loro insieme questi risultati indicano che la trasmissione sinaptica eccitatoria è fortemente alterata nel modello animale della malattia Niemann-Pick di tipo C utilizzato, supportando l’importanza di tali meccanismi nell’insorgenza dei disturbi neurologici associati con la patologia umana.
Risultati attesi:
1. Identificazione dei microdomini di membrana come bersaglio terapeutico nel trattamento delle patologie legate allo squilibrio del traffico cellulare dei lipidi
2. Identificazione di un possibile ruolo dell’ insulina e del suo recettore nei disturbi cognitivi associati con la NPC
3. Individuazione di marcatori diagnostici nelle cellule di sangue periferico di pazienti NPC.

29. Identificazione di marcatori biologici della sclerosi laterale amiotrofica

L’ossido nitrico (NO) è una molecola radicalica, prodotta fisiologicamente dall’enzima NO sintasi (NO), che nell’organismo esercita un ampio spettro di azioni. Data la sua elevata reattività, l’NO esplica le sue funzioni legandosi all’eme delle proteine, ai gruppi tiolici delle cisteine proteiche o non proteiche (S-nitrosilazione) e ai residui di tirosina delle proteine (nitrazione). Alterazione dell’omeostasi degli S-nitrosotioli (SNO) e del processo di nitrazione dipende non soltanto dall’alterata produzione di NO da parte dell’ossido nitrico sintasi ma anche da cambiamenti nell’attività delle denitrosilasi e denitrasi, enzimi che rimuovono il gruppo NO.  Nell’ultimo decennio, numerosi studi hanno dimostrato che un’alterata produzione di NO e/o uno squilibrio nella formazione o nel mantenimento della quota di specie nitrate o S-nitrosilate sono eventi che si riscontrano in molte patologie neurodegenerative. Danni da stress nitrosativo ed ossidativo sono stati determinati nel midollo spinale, corteccia, fluido cerebrospinale e nel plasma di pazienti affetti da sclerosi laterale amiotrofica (SLA), una malattia neurodegenerativa caratterizzata dalla perdita selettiva dei motoneuroni. Inoltre, studi recenti suggeriscono che non solo l’eccesso ma anche la carenza delle proteine S-nitrosilate contribuisce  all’instaurarsi della malattia.
Lo studio si prefigge di:
- Chiarire il ruolo dello stress nitrosativo nella SLA;
- Identificare determinanti e parametri comuni di stress nitrosativo ;
- Caratterizzare gli effetti di molecole in grado di modulare il danno ossidativo/nitrosativo, (antiossidanti,  inibitori della sintesi di NO).
Le analisi ex vivo sono state condotte su campioni di plasma e linfociti isolati dal sangue venoso di pazienti affetti da SLA mediante procedure standard che utilizzano gradiente di Ficoll/Paque. Come controlli sono stati utilizzati campioni ottenuti da individui con quadro clinico sano e pari età. La concentrazione di NO nel plasma è stata determinata misurando i livelli di nitriti (metodo colorimetrico di Griess e metodo fluorimetrico di Saville). Come marcatori dello stress nitrosativo sono stati seguiti i livelli di proteine nitrate nei linfociti mediante Western blot, utilizzando un anticorpo anti-nitrotirosine, e valutando la concentrazione nel plasma di S-nitrosotioli mediante metodo di Saville previa incubazione con HgCl2.
Negli studi in vitro sono state utilizzate cellule di neuroblastoma in cui la carenza di SOD1 e la sovraespressione di NO sintasi neuronale sono state ottenute mediante tecniche di biologia cellulare e molecolare. Il trattamento con SNP, un donatore di NO, è stato effettuato alla concentrazione di 1 mM fino a 24 h. L’analisi del glutatione è stata condotta mediante HPLC ed i livelli di attivazione del pathway di cdk5/p35 e p53 analizzati mediante Western blotting avvalendosi dell’uso di anticorpi specifici contro le forme fosfo-attive. La depolimerizzazione dei microfilamenti di actina è stata valutata mediante l’uso di microscopia a fluorescenza, previa marcatura con falloidina marcata, o tramite Western blotting su frazioni proteiche citoscheletriche, ottenute mediante lisi cellulare in tamponi contenenti il detergente Triton X-100.
Durante il primo anno è stato possibile raccogliere solo un numero esiguo di campioni biologici di pazienti affetti da SLA. Tuttavia, è stato possibile mettere a punto i metodi di misurazione degli S-nitrosotioli e delle proteine nitrosilate.
Dagli studi condotti su modelli in vitro riconducibili alla patologia è emerso che la carenza di SOD1 determina una progressiva disfunzione della struttura citoscheletrica neuronale a sua volta dovuta all’attivazione di pathways chinasici tipici della cellula nervosa (cdk5/p35). In particolare, si determina una depolimerizzazione dei microfilamenti di actina che può essere prevenuta mediante trattamento con l’antiossidante N-acetilcisteina. L’azione di questa molecola si esplica attraverso l’inibizione dell’attivazione della via chinasica superossido-dipendente cdk5/p35, presumibilmente grazie alla sua capacità di intercettare il superossido e  i prodotti reattivi dell’NO prodotti in assenza di SOD1. Inoltre, è stato dimostrato che lo stress nitrosativo/ossidativo, indotto mediante sovraespressione dell’enzima NO sintasi o mediante sodio nitroprusside (SNP), può causare un’alterazione dell’omeostasi cellulare che in un’ultima analisi può condurre ad arresto della crescita e morte neuronale p53-mediata. Lo stress nitrosativo di provenienza endogena (indotto cioè da sovraespressione di NO sintasi) può essere prevenuto o mediante inibizione dell’attività della NO sintasi o attraverso l’aumento del pool intracellulare di glutatione ridotto, che può funzionare da riserva endogena di NO (formazione di S-nitrosoglutatione). Infatti, l’inibizione chimica della sua sintesi mediante BSO, determina un’aumentata suscettibilità alla tossicità dell’NO. Lo stress ossidativo/nitrosativo, esogeno causato da trattamento con SNP, può essere prevenuto attraverso incubazione con deferossamina (chelante del ferro), DMSO, DMTU e TEMPOL (scavengers dei radicali dell’ossigeno).
Nel secondo anno di ricerca si intende continuare la raccolta di campioni di sangue da pazienti affetti da SLA allo scopo di poter valutare la possibile alterazione del metabolismo dell’NO e di identificare marcatori predittivi della patologia. L’analisi sarà condotta non solo nei campioni di plasma ma anche nei linfociti e monociti con particolare riguardo al grado di espressione della NO sintasi inducibile.
Su modelli in vitro si analizzeranno gli effetti della carenza di glutatione sul metabolismo dell’NO con particolare riguardo all’alterazione dei processi di S-nitrosilazione

 30. Studio dei meccanismi fisiopatologici della malattia di Parkinson:valutazione di terapie innovative in modelli sperimentali

Il mitocondrio e lo stress ossidativo derivato da alterazioni della sua funzionalità sono implicati nell’eziopatogenesi del morbo di Parkinson (PD). La conseguente produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) sembra determinare la selettiva perdita di funzionalità dei neuroni dopaminergici del pathway nigro-striatale, anche se, a tutt’oggi, non è ancora chiaro se lo stress ossidativo rappresenti la causa o la conseguenza dello stato patologico. Esiste una stretta associazione tra i due eventi e l’esposizione a stress ossidativo può essere non solo un fattore di rischio, ma anche un induttore primario. A conferma di quanto detto, esistono numerose evidenze sperimentali a favore di un’azione protettiva di diverse classi di antiossidanti in modelli di neurodegenerazione, tra cui il PD. Tra gli antiossidanti studiati, quelli a cui è stato dato maggior rilievo sono i polifenoli, una classe eterogenea di sostanze naturali presenti in vegetali, frutta e derivati. In realtà, non è ancora chiaro se i polifenoli agiscano soltanto da antiossidanti o se la loro azione neuroprotettiva dipenda da caratteristiche peculiari e specifiche di ogni molecola. Lo studio si prefigge di:
- Caratterizzare l’azione neuroprotettiva di diversi flavonoidi in modelli sperimentali di PD;
- Identificare i target cellulari  su cui agiscono i flavonoidi in maniera indipendente dalla loro attività anti-ossidante;
- Caratterizzare in vitro e in vivo la funzionalità delle cellule neuronali in modelli di PD in seguito a trattamento con i flavonoidi;
- Identificare ulteriori molecole neuroprotettive di sintesi o assimilabili con la dieta.
Sono state utilizzate linee cellulari umane AGS, HeLa e SH-SY5Y incubate con differenti polifenoli (campferolo, resveratrolo, quercetina e miricetina) e trattate con induttori di morte (rotenone, MPP+ e 6-OHDA), in terreni arricchiti o meno con glucosio. La vitalità e la morte cellulare sono state valutate mediante conta diretta previa esclusione da Trypan blue; dall’analisi in fluorescenza della morfologia nucleare dopo colorazione con Hoechst 33342, o in citofluorimetria, previa marcatura con ioduro di propidio. L’attivazione del pathway apoptotico è stata confermata dall’uso dell’inibitore delle caspasi zVAD-fmk e monitorata mediante l’analisi in Western blotting delle caspasi 9/3 e PARP. Il potenziale trans-membrana (m) e la morfologia mitocondriale sono state valutate mediante citofluorimetria, previa colorazione con MitoTracker Red e marcatura con anticorpi anti-Hsp60; mentre la funzionalità del mitocondrio è stata determinata con analisi polarografiche del consumo di O2 su mitocondri purificati e su cellule intatte. E’ stata inoltre valutata l’energetica cellulare, mediante saggi chemioluminescenti del contenuto di ATP e spettrofotometrici della concentrazione extracellulare di lattato. L’uptake di glucosio è stato seguito mediante saggi fluorimetrici e citofluorimetrici dell’analogo non ossidabile del glucosio, 2-NBDG. Lo stato redox cellulare è stato misurato analizzando la produzione di ROS mediante l’uso di sonde fluorescenti specifiche per il superossido (DHE) e l’H2O2 (DHDCF-DA), nonché i livelli di proteine carbonilate nella frazione mitocondriale e citosolica. L’autofagia è stata valutata mediante l’analisi morfologica delle cellule e citofluorimetrica del pH intracellulare, mediante marcatura con arancio di Acridina. Sono stati inoltre valutati i livelli di LC3-II associati agli autofagolisosomi sia in Western blotting che in microscopia a fluorescenza, dopo trasfezione con un plasmide esprimente la chimera EGFP-LC3, seguendo la co-localizzazione con il probe fluorescente specifico per i lisosomi,  LysoTracker Red. È stato in ultimo determinato il grado di attivazione di p53, Akt, mTOR, c-Jun e dei membri delle MAPK, p38, JNK, ERK1/2 e MEK1/2, in Western blotting mediante l’uso di anticorpi specifici contro le forme fosforilate. L’attivazione è stata confermata attraverso l’uso di inibitori chimici e/o di siRNA specifici per queste proteine.
Gli studi condotti dal laboratorio hanno evidenziato che il campferolo, ma non altri polifenoli, è in grado di proteggere cellule dopaminergiche umane SH-SY5Y contro la citotossicità indotta dalle tossine mitocondriali rotenone e MPP+, utilizzate per riprodurre in vitro la morte cellulare assimilabile al PD. Il campferolo è in grado non solo di prevenire l’attivazione delle caspasi, ma di inibire tutta la cascata pro-apoptotica derivante dalla disfunzione mitocondriale: produzione di ROS; perdita di m; attivazione di JNK e p38. E’ sato inoltre dimostrato che, accanto a questa azione prettamente anti-ossidante, il campferolo induce un aumento di LC3-II e dell’acidità cellulare, segni che suggeriscono l’attivazione del processo autofagico. Analisi in microscopia a fluorescenza indicano inoltre un cambiamento morfologico tipico di mitocondri in fissione (formazione di donuts mitocondriali), evento che indicherebbe nell’autofagia specifica dei mitocondri (mitofagia) un processo fortemente associato ai fenomeni di protezione campferolo-mediati. Per valutare come il campferolo agisca da induttore autofagico sono stati condotti esperimenti su cellule HeLa, dimostrando che, l’evento causativo  dell’autofagia è rappresentato da un’alterazione dell’omeostasi energetica cellulare. In particolare, si è osservato che il campferolo influenza direttamente sia il consumo di O2 mitocondriale, sia l’incorporazione di glucosio. Questi fenomeni producono, in ultima analisi, una deplezione di ATP e l’attivazione dell’autofagia; infatti, l’aggiunta di glucosio al terreno di coltura ritarda significativamente la localizzazione di LC3-II sugli autofagolisosomi e l’acidificazione intracellulare. E’ stato inoltre dimostrato che l’autofagia è un processo reversibile, modulato da p53 e indotto in seguito ad attivazione dai pathway mediati da Akt/mTOR e ERK1/2. Prova ulteriore di come i polifenoli, al di là delle loro proprietà anti-ossidanti, possano agire sul metabolismo cellulare, è stata fornita dagli studi del laboratorio sugli effetti del resveratrolo sull’inibizione diretta della fosforilazione di ERK1/2 da parte MEK1/2 . Dato che ERK1/2 è implicata nei processi di autofagia indotti da deprivazione di nutrienti, questi dati suggeriscono un possibile ruolo di modulatore dell’autofagia, anche per il resveratrolo.
Nel secondo anno di ricerca si intende caratterizzare a fondo l’azione neuroprotettiva dal campferolo su cellule SH-SY5Y, evidenziando i processi di mitofagia mediante microscopia elettronica, nonché mediante l’uso di inibitori chimici (wortmannina, monensina, NH4Cl, ciclosporina A) e genetici (siRNA contro Atg5) del processo di formazione degli autofagolisosomi. Ci proponiamo inoltre di confermare i dati ottenuti in vitro anche su sistemi ex vivo, quali neuroni primari di topo e fettine di ratto trattate con rotenone. Vengono approfonditi gli studi sull’azione del campferolo quale induttore di fissione dei mitocondri. A tal proposito si intende delineare i meccanismi molecolari che sottendono questo fenomeno, investigando se il campferolo sia in grado di modulare l’espressione/attività di proteine coinvolte nel rimaneggiamento della rete mitocondriale (Fis1, DRP1, OPA1). I risultati saranno fondamentali in neurobiologia per comprendere se il campferolo (e anche altri polifenoli, naturali o di sintesi) possano modulare il turnover dei mitocondri.